用于Pin1异构活性检测的生物探针及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种用于Pin1异构活性检测的生物探针及其应用。该生物探针由供

【技术实现步骤摘要】
用于Pin1异构活性检测的生物探针及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于Pin1异构活性检测的生物探针及其应用。

技术介绍

[0002]脯氨酰顺反异构酶1(peptidyl
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prolyl cis
‑
trans isomerase NIMA
‑
interacting1,Pin1)是一种能与蛋白质NIMA相互作用的肽脯氨酰顺反异构酶，也是目前所知道的唯一催化顺反异构的酶。Pin1由N端WW结构域，中间的柔性链接体及C端的PPIase结构域构成，每个结构域都有不同的配体结合位点，但只有PPIase结构域具有催化底物异构化的活性。人类代谢性疾病、心血管疾病、神经退行性疾病及癌症等疾病的发生与转归与细胞内肽酰脯氨酰顺反异构酶1活性异常相关，尤其是Pin1能够促进癌症发生、增殖、侵袭与转移，而成为治疗癌症的一个重要靶点。Pin1靶向药物筛选、癌症及阿尔茨海默病(AD)的诊断、转归与预后等活动都离不开细胞内Pin1活性的检测。
[0003]除少数报道外，目前针对细胞内Pin1的检测，大多采用PCR、定量PCR及各种免疫学原理的实验方法在转录水平及翻译水平上对细胞中Pin1表达含量和活性进行鉴定，如免疫组化、免疫印迹及免疫荧光等。然而这些方法不仅操作繁琐、需要耗费大量的人力物力，而且还需要将细胞破碎才能进行检测。尤其是，这些传统检测方法得到的结果只能说明Pin1蛋白或mRNA的丰度，又或者是Pin1与底物的相互作用，而不能说明Pin1的异构活性变化。以往针对Pin1催化底物异构检测的方法只见于神经细胞中的Tau(pThr231
‑
Pro232)，在其它细胞中Pin1异构活性检测的方法很少见于报道。
[0004]荧光共振能量转移(FRET)技术在探测分子微小空间距离变化方面具有得天独厚的优势。在前期研究中我们发现Pin1靶位点(pSer/Thr
‑
Pro)两端的距离会随着pSer/Thr
‑
Pro的构象变化而改变，本专利根据荧光共振能量转移(FRET)原理，首次拟用Ser/Thr
‑
Pro基序作为识别域构建能在不同活细胞内检测Pin1异构活性和构象变化方向的FRET生物探针，并用该探针在不同Pin1表达水平的细胞内，探讨Pin1的异构活性及构象变化响应的机制。本专利为后续开展癌症及AD发生机制、早期诊断及抗癌药物的高通量筛选设备等研究打下基础。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供一种基于荧光共振能量转移原理的生物探针，该探针可通过转基因技术转移到细胞内，并将细胞内Pin1的异构活性转换成不同波长的荧光信号，从而实现非损伤检测细胞内Pin1的异构活性。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]基于荧光共振能量转移原理的生物探针，所述生物探针由供
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受体对、连接体和Pin1识别域组成；所述供
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受体对为两种颜色不同的荧光蛋白；所述Pin1识别域为含有Pin1的潜在识别位点Ser/Thr
‑
Pro的肽段；所述连接体为富含疏水氨基酸残基短肽。
[0008]本专利前期研究发现Pin1能特异性识别并导致外源性探针构象发生变化；同时研究表明癌症因子能特异性识别并导致外源性探针构象发生变化。
[0009]进一步，供体为一种称为mClover3的绿色荧光蛋白，受体为一种称为mRuby3红色荧光蛋白。
[0010]进一步，所述Pin1的序列如SEQ ID No.1所示。
[0011]进一步，所述连接体包括连接体1和连接体2；所述连接体1与所述供体和所述Pin1识别域相连；所述连接体2与所述受体和所述Pin1识别域相连；所述连接体1和所述连接体2的氨基酸残基序列相同，如SEQ ID No.2所示。
[0012]进一步，所述供体和所述受体的空间距离为1～10.08nm。
[0013]进一步，根据Pin1与底物分子结合后导致Pin1产生的反式(trans)和顺式(cis)两种不同的构象，分别设计不同的Pin1识别域；trans
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识别域的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；cis
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识别域的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0014]识别域是探针的重要核心组成部分，其设计成功与否，直接影响到FRET生物探针能否被细胞内生物分子对探针识别，并将细胞内的生物信息转化为可被共聚焦荧光显微镜等细胞外仪器接收和分析的荧光信号。本专利研究发现当供体、受荧光基团的空间距离在1
‑
10.08nm之间范围时，具有最佳的FRET效应。作为迄今发现的哺乳动物细胞内唯一催化蛋白质顺反异构的酶，Pin1发挥其异构化作用的前提是，其底物蛋白识别位点Ser
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Pro或Thr
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Pro必须能被细胞内激酶识别和磷酸化修饰。但对于转基因导入的外源性探针蛋白而言，尽管探针识别域上的Ser
‑
Pro或Thr
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Pro同样也是Pin1潜在的结合与异构位点，由于受FRET供
‑
受体荧光对基团的影响，并非所有的探针识别域都能被细胞内激酶识别和磷酸化修饰，从而被Pin1识别与结合并在结合位点处发生异构化反应。
[0015]我们前期研究发现，专利技术所述探针导入Pin1高水平表达细胞后，探针识别域(SEQ IDNo.3及SEQ ID No.4)的Ser/Thr
‑
Pro异构化会导致两端中心碳原子的距离发生0.1nm左右的变化、及肽键发生180
°
的方向扭转。而用于构建FRET生物探针的“连接体1
‑
识别域
‑
连接体2”组件由30个左右的氨基酸残基组成，两端供受体荧光基团的直线空间最大距离(按氨基酸残基之间平均距离为0.36nm计算)为10.08nm。故本专利技术所述探针供
‑
受体荧光对之间距离的变化范围与FRET效应的有效距离范围(1
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10nm)基本吻合。此外，本专利技术前期研究还发现，当细胞内Pin1的异构活性发生改变时，供体与受体之间的FRET值也会随着发生改变。所不同的是，SEQ ID No.3识别域在Pin1高水平表达细胞中的FRET值变小，提示trans构象分子增多；而SEQ ID No.4识别域的表现则刚好相反，在Pin1高水平表达细胞中的FRET值变大，提示cis构象分子增多。而这两种改变引起的FRET值变化都可被共聚焦荧光显微镜等仪器所观测，故含有这两种识别域的探针都可以用于细胞内Pin1异构活性的检测。
[0016]进一步，利用所述生物探针检测离体细胞内Pin1异构活性的方法为：利用化学合成法合成所述生物探针融合蛋白的编码基因DNA片段；然后用DNA重组技术将所述DNA片段插入到真核基因表达质粒的多克隆位点上，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于荧光共振能量转移原理的生物探针，其特征在于，所述生物探针由供
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受体对、连接体和Pin1识别域组成；所述供
‑
受体对为两种颜色不同的荧光蛋白；所述Pin1识别域为含有Pin1的潜在识别位点Ser/Thr
‑
Pro的肽段；所述连接体为富含疏水氨基酸残基短肽。2.根据权利要求1所述的生物探针，其特征在于，供体为一种称为mClover3的绿色荧光蛋白，受体为一种称为mRuby3红色荧光蛋白。3.根据权利要求1所述的生物探针，其特征在于，所述Pin1的序列如SEQ ID No.1所示。4.根据权利要求1所述的生物探针，其特征在于，所述连接体包括连接体1和连接体2；所述连接体1与所述供体和所述Pin1识别域相连；所述连接体2与所述受体和所述Pin1识别域相连；所述连接体1和所述连接体2的氨基酸残基序列相同，如SEQ ID No.2所示。5.根据权利要求1所述的生物探针，其特征在于，所述供体和所述受体的空间距离为1～10.08nm。6.根据权利要求1所述的生物探针，其特征在于，根据Pin1与底物分子结合后导致Pin1产生的trans和cis两种不同的构象，分别设计不同的Pin1识别域；trans
‑
识别域的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；cis
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识别域的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。7.根据权利要求1所述的生物探针，其特征在于，利用所述生物探针检测离体细胞内Pin1异构活性的方法为：利用化学合成法合成所述生物探针融合蛋白的编码基因DNA片段；然后用DNA重组技术将...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨应斌，于淑惠，谭紫仙，王新烨，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：