构建嵌合蛋白的嵌合区域、构建方法、嵌合蛋白及其应用技术

本发明专利技术公开了一种嵌合蛋白，包括细胞因子以及细胞因子受体胞外域；细胞因子嵌入到细胞因子受体胞外域的嵌合区域中，嵌合区域位于细胞因子受体胞外域柔性连接区，或细胞因子受体胞外域嵌入到该细胞因子的嵌合区域中，嵌合区域位于细胞因子柔性连接区。本发明专利技术公开了通过在CD25和IL

【技术实现步骤摘要】
构建嵌合蛋白的嵌合区域、构建方法、嵌合蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域。具体而言，本专利技术涉及一种用于构建嵌合蛋白的嵌合区域、构建方法、嵌合蛋白、制备方法以及应用，本专利技术还涉及该嵌合蛋白的衍生物、缀合物、药物组合、核酸分子、表达载体和宿主细胞。

技术介绍

[0002]细胞因子(cytokine，CK)是细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，按照其功能可分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。细胞因子通过结合细胞表面相应的细胞因子受体，介导细胞内信号转导而发挥多种生物学功能，包括免疫调节、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等。因此基于细胞因子的药物是药物开发中的重要领域。然而许多天然的细胞因子并不适合作为药物。因为一种细胞因子通常可结合多种表达在不同细胞表面的多种受体，传递着不同的信号，另外同一种受体也可以结合不同的细胞因子，这导致细胞因子的作用具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性。临床治疗中需要特定激活细胞因子参与的一个特异信号，而不激活不必要的信号，进一步执行预期功能，而达到治疗效果好而毒副作用小的目的。细胞因子受体绝大多数是跨膜蛋白，由胞外域、跨膜区和胞浆区组成。
[0003]例如，以白细胞介素2为例，白细胞介素2(Interleukin
‑
2，IL
‑
2)也称作T细胞生长因子(TCGF)，是一种15.5kDa球状糖蛋白，它具有133个氨基酸的长度。IL
‑
2的结构由四个反平行的、两亲性的α螺旋和一些链接序列(loop)组成(Smith，Science240，1169
‑
76(1988)；Bazan，Science257，410
‑
413(1992))。IL
‑
2主要来源于活化的CD4+T细胞、活化的CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞和巨噬细胞，可通过与细胞表面的IL
‑
2受体结合来调节其作用。
[0004]IL
‑
2受体是由三个亚基组成的复合体，三个亚基分别为IL
‑
2Rα(即CD25)、IL
‑
2Rβ(即CD122)和IL
‑
2Rγ(即CD132)。这三个亚基的表达以及他们与IL
‑
2的亲和力各不相同。其中IL
‑
2Rβ亚基和IL
‑
2Rγ亚基形成的异源二聚IL
‑
2受体主要由细胞毒性CD8+T细胞和NK细胞表达，与IL
‑
2中等亲和力结合，称为中等亲和力IL
‑
2受体(IL
‑
2Rβγ)。由IL
‑
2Rα亚基、IL
‑
2Rβ亚基和IL
‑
2Rγ亚基形成的异源三聚IL
‑
2受体主要表达在调节性T细胞(Treg)(Byman，0.和Sprent.J.Nat.Rev.Immunol.12，180
‑
190(2012))，并与IL
‑
2高亲和性结合(亲和力比二聚体受体高约100倍)，称为高亲和力IL
‑
2受体(IL
‑
2Rαβγ)。另外发现一些内皮细胞表面也有IL
‑
2的受体α(CD25)亚基的表达。IL
‑
2Rβ和IL
‑
2Rγ是IL
‑
2激活下游信号通路所必需的，当IL
‑
2同时结合IL
‑
2Rβ和IL
‑
2Rγ时，两个受体亚基形成异源二聚体，磷酸化细胞内的STAT5，进入细胞核导致相应的基因转录和表达；IL
‑
2Rα并非信号所必需，但可以促进IL
‑
2与IL
‑
2Rβ和IL
‑
2Rγ的结合。IL
‑
2Rγ在所有免疫细胞中均有表达；IL
‑
2Rβ在CD8+T细胞、NK细胞、调节性T细胞中均有表达，而且在T细胞被激活后还会提升表达水平；IL
‑
2Rα在调节性T细胞持续高表达，在被激活的CD8+T细胞中会有短暂表达，随即下调表达水平。由于静息状态的效应T细胞和NK细胞在细胞表面上没有IL
‑
2Rα，故对于IL
‑
2相对不敏感。而Treg细胞在
体内一贯表达最高水平的IL
‑
2Rα，因此，正常情况下IL
‑
2会优先剌激Treg细胞增殖。
[0005]IL
‑
2在体内具有扩充淋巴细胞群体和提高这些细胞的效应器的功能，尤其是对CD8+T细胞和NK细胞的增殖和活化赋予了IL
‑
2的抗肿瘤能力。IL
‑
2是历史上第一个用于肿瘤免疫治疗的细胞因子，抗肿瘤作用已得到临床证实。高剂量IL
‑
2治疗已经批准用于具有转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤的患者。经过多年的临床应用，人们对于IL
‑
2的认识更加深入，IL
‑
2的临床应用也带来了诸多问题。
[0006]首先与IL
‑
2免疫疗法有关的一项担忧是由重组人IL
‑
2治疗产生的副作用。接受高剂量IL
‑
2治疗的患者发生血管(或毛细血管)渗漏综合征(VLS)，血管通透性的一种病理性升高，导致多个器官中的流体外渗(引起例如肺和皮肤水肿和肝细胞损伤)和血管内流体消减(引起血压下降和心率补偿性升高)。除了IL
‑
2停药以外，VLS没有治疗。研究发现，发生VLS可能与IL
‑
2与内皮细胞表达的IL
‑
2RA结合有关(Kriegetal.，ProcNatAcadSciUSA107，11906
‑
11(2010))。其次，由于IL
‑
2与高表达在抑制性调节T细胞(Treg)的高亲和力IL
‑
2受体结合，而维持外周Treg细胞的数量和活性(MaloyandPowrie，NatureImmunol6，1171
‑
72(2005))。Treg细胞遏制效应T细胞破坏它们的靶物；或是经由细胞
‑
细胞接触抑制T细胞辅助和激活；或是经由释放免疫遏制性细胞因子，诸如IL
‑
10或TGF
‑
β，消减IL
‑
2诱导的抗肿瘤免疫力(Imaietal.，CancerSci98，416
‑
23(2007))。另外，由于IL
‑
2的分子量较小，其在体内的半衰期短，需要持续给药才能维持体内高浓度的IL
‑
2。
[0007]抑制IL
‑
2与高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合蛋白，其特征在于，包括细胞因子以及细胞因子受体胞外域；所述的细胞因子嵌入到细胞因子受体胞外域的嵌合区域中，所述嵌合区域位于细胞因子受体胞外域柔性连接区，所述的嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：C1‑
I
‑
C2，式中C1为细胞因子受体胞外域嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，C2为细胞因子受体胞外域中除C1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物；I为细胞因子或者细胞因子的变体、改造体、截断体或衍生物；或所述的细胞因子受体胞外域嵌入到该细胞因子的嵌合区域中，所述的嵌合区域位于细胞因子柔性连接区；所述的嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：I1‑
C
‑
I2；式中I1为细胞因子嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，I2为细胞因子中除I1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物；C为细胞因子受体胞外域或者细胞因子受体胞外域的变体、改造体、截断体或衍生物。2.如权利要求1的嵌合蛋白，其特征在于：所述的C1、C2、I1、I2至少含有三个氨基酸，或者至少含有一个独立的蛋白质二级结构单元。3.如权利要求1所述的嵌合蛋白，其特征在于：所述的C1和C2通过接头元件间接同I连接；所述的嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：C1‑
L1‑
I
‑
L3‑
C2；或所述的I1和I2通过接头元件间接同C连接，所述的嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：I1‑
L1‑
C
‑
L3‑
I2；上述式中L1，L3为各自独立的接头元件，L1和L3为相同或不同序列。4.如权利要求3所述的嵌合蛋白，其特征在于：所述的多肽结构式C1‑
L1‑
I
‑
L3‑
C2中的I在其嵌合位点前或者后的两部分氨基酸序列I1和I2通过接头元件L2连接，即嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：C1‑
L1‑
I1‑
L2‑
I2‑
L3‑
C2；式中I1为细胞因子嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，I2为细胞因子中除I1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物；或所述的多肽结构式I1‑
L1‑
C
‑
L3‑
I2中的C在其嵌合位点前或者后的两部分氨基酸序列C1和C2通过接头元件L2连接，即嵌合蛋白从N端到C端具有如下所示的多肽结构式：I1‑
L1‑
C1‑
L2‑
C2‑
L3‑
I2；式中C1为细胞因子受体胞外域嵌合区域中任一嵌合位点前或后的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物，C2为细胞因子受体胞外域中除C1外的氨基酸序列或其变体、改造体、截断体或衍生物。5.如权利要求4所述的嵌合蛋白，其特征在于：还包括免疫球蛋白Fc区。6.如权利要求1～5任一项所述的嵌合蛋白，其特征在于：所述的细胞因子受体为CD25，所述的细胞因子为IL
‑
2；或所述的细胞因子受体为IL15RA，所述的细胞因子为IL
‑
15；或所述的细胞因子受体为IL21R，所述的细胞因子为IL
‑
21。7.如权利要求6所述的嵌合蛋白，其特征在于：CD25胞外域的序列号为SEQ ID NO:1，CD25的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1进行编号；C1包含以下任一氨基酸序列：(a)、CD25胞外域上的如下肽段:E1
‑
R36，或E1
‑
I37，或E1
‑
K38，或E1
‑
S39，或E1
‑
G40，或E1
‑
S41，或E1
‑
L42，或E1
‑
M149，或E1
‑
T150，或E1
‑
H151，或E1
‑
G152，或E1
‑
K153，或E1
‑
T154；(b)、(a)中所述肽段在其他(非人源)物种的同源肽段；(c)、将(a)或者(b)中任一肽段的氨基酸序列经过一个或多个(如1
‑
10个)氨基酸残基
NO:1进行编号，所述的嵌合区域位于CD25胞外域的柔性连接区，包括嵌合区Q1和嵌合区Q2：a.嵌合区Q1位于CD25胞外域的I37
‑
K38
‑
S39
‑
G40
‑
S41
‑
L42肽段，序列号为SEQ ID NO:3，或该肽段的同源肽段或具有与该肽段类似结构和功能的衍生肽段，或该肽段向前向后各延伸10个氨基酸的肽段，序列号为SEQ ID NO:5；b.嵌合区Q2位于CD25胞外域的T150
‑
H151
‑
G152
...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁耀极，刘杰，
申请(专利权)人：厦门柏慈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：