一种GnRH6-CRM197重组蛋白去势疫苗及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种GnRH6

【技术实现步骤摘要】
一种GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗及制备方法


[0001]本专利技术涉及分子疫苗学领域，具体涉及一种GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗及制备方法。

技术介绍

[0002]传统去势术较为常用的方式为手术阉割法，这种方法对场地、环境、操作等均有较高的要求，与此同时手术会产生副作用，如感染率高导致一定的死亡，且对家畜年出栏量巨大的中国而言带来一定的困难，另外手术成本较高，也不利于动物福利，这种沿袭千年的手术阉割正受到规模化、标准化畜牧生产需求的挑战，研究表明，免疫去势术具有方便高效、可逆、安全等优点，因此，免疫去势技术最有望成为传统去势术的替代者。
[0003]下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(Gonadotropin
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re1easing hormone，GnRH)在生殖内分泌调节中起决定性的作用，其主要生物学功能是控制脑下垂体前叶细胞合成和分泌促黄体激素(1uteinizing hormone,LH)及促卵泡激素(Fo11ic1e
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stimμ1ating hormone,FSH)，即调控生殖轴。研究表明，在雄性动物中FSH和LH与发情、交配等生殖活动以及睾丸发育和精子生成等密切相关，因此通过免疫GnRH,诱导GnRH的抗体产生，体内中和GnRH进而减少GnRH水平，导致LH和FSH合成减少，而伴随发情、睾丸发育和精子生成的破坏，最终达到绝育的目的。在GnRH免疫去势疫苗的研究方面，早期的化学合成肽疫苗以GnRH单体与载体蛋白连接而成，但用GnRH单体构建的疫苗几乎在所有的免疫动物，免疫效果均不稳定，免疫原性不强，即使在同一批试验的同一品种动物对疫苗免疫的反应差异也很大，有的甚至对疫苗没有反应。方富贵等展开了对GnRH六聚体的免疫原性的研究，发现其具有一定的免疫原性，为进一步增提高GnRH主动免疫效果，选择一种增强其免疫原性的载体蛋白十分必要。经研究证实白喉毒素突变体CRM197作为载体蛋白可增强免疫效果，是一种弱抗原的良好载体，我们在GnRH六聚体的基础上，连接白喉毒素突变体CRM197来增强其免疫原性。目前关于GnRH疫苗国内外报道已很多，但仍没有一种达到商业化应用，究其原因为免疫原性不强以及成本较高。且目前对于GnRH六聚体和CRM197蛋白联合运用的研究未见报道，因此有必要研制出一种免疫原性强、低成本的GnRH六聚体与CRM197的融合蛋白疫苗。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗及制备方法，其提高了低分子量抗原免疫原性，提高了抗原的免疫效果，避免了多肽不稳定的效果。
[0005]在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种GnRH重组蛋白抗原。根据本专利技术的实施例，所述GnRH重组蛋白抗原的氨基酸序列如序列表Seq_1所示。
[0006]在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗。根据本专利技术的实施例，所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗中含有所述的GnRH重组蛋白抗原。
[0007]另外，根据本专利技术上述实施例的一种GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗，还可以具有如下附加的技术特征：
[0008]在本专利技术的一些实施例中，所述GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗含有哺乳动物GnRH序列，所述哺乳动物包括犬、猫、宠物猪、荷兰猪、小鼠。
[0009]在本专利技术的一些实施例中，所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗含有序列表Seq_2的犬GnRH序列。
[0010]在本专利技术的一些实施例中，所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗含有序列表Seq_3的山羊CRM197序列。
[0011]在本专利技术的一些实施例中，所述GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗含有序列表Seq_1的GnRH6
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CRM197转化大肠杆菌表达的重组蛋白。
[0012]在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种GnRH6
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CRM197转化大肠杆菌。根据本专利技术的实施例，所述GnRH6
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CRM197转化大肠杆菌于于2022年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.25027，分类命名为Escherichia coli，具体命名为BL21(DE3)
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PET21a
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GnRH6
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CRM197，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101，所述GnRH6
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CRM197转化大肠杆菌表达含序列表Seq_1的氨基酸的重组蛋白。
[0013]在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种GnRH6
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CRM197转化大肠杆菌的构建方法。根据本专利技术的实施例，包括以下步骤:
[0014](1)根据哺乳动物GnRH序列和山羊CRM197序列，设计包含选定的GnRH六聚体重组CRM197序列；
[0015](2)采用密码子优化系统设计合成带BamH I和Xho I酶切位点的DNA序列，经BamH I和Xho I双酶切后DNA产物与同样酶切的载体PET21a连接，获得连接液；
[0016](3)随后将连接液转入大肠杆菌DH5α，筛选得到质粒PET21a
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GnRH6
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CRM197，通过将质粒GnRH6
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CRM197转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株得到工程菌BL21(DE3)
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PET21a
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GnRH6
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CRM197，最终表达含序列表Seq_1的氨基酸的重组蛋白，即为所述GnRH6
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CRM197转化大肠杆菌。
[0017]在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗的制备方法。根据本专利技术的实施例，将所述的GnRH6
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CRM197转化大肠杆菌进行破菌纯化得到含序列表Seq_1的氨基酸的重组蛋白，即为所述GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗。
[0018]在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗的应用。根据本专利技术的实施例，所述GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗用于哺乳动物生育能力控制。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0020]1)本专利技术采取GnRH六聚体和CRM197蛋白重组的方式，提高了低分子量抗原免疫原性和抗原的免疫效果，避免了多肽不稳定的效果；同时本专利技术使用的是重组GnRH6
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CRM197蛋白，减少了多肽合成制剂成本，使用更加便利。
[0021]2)本专利技术所制备的B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种GnRH重组蛋白抗原，其特征在于：所述GnRH重组蛋白抗原的氨基酸序列如序列表Seq_1所示。2.一种GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗，其特征在于：所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗中含有权利要求1所述的GnRH重组蛋白抗原。3.根据权利要求2所述的GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗，其特征在于：所述GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗含有哺乳动物GnRH序列，所述哺乳动物包括犬、猫、宠物猪、荷兰猪、小鼠。4.根据权利要求3所述的GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗，其特征在于：所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗含有序列表Seq_2的犬GnRH序列。5.根据权利要求2所述的GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗，其特征在于：所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗含有序列表Seq_3的山羊CRM197序列。6.根据权利要求2所述的GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗，其特征在于：所述GnRH6
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CRM197重组蛋白去势疫苗含有序列表Seq_1的GnRH6
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CRM197转化大肠杆菌表达的重组蛋白。7.一种GnRH6
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CRM197转化大肠杆菌，其特征在于：所述GnRH6
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CRM197转化大肠杆菌于于2022年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.25027，分类命名为Escherichia coli，具体命名为BL21(DE3)
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PET21a
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GnRH6
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【专利技术属性】
技术研发人员：龚新豹，陆君泰，徐爽爽，张为，闫旭，叶菁，秦平，辛洪雷，刘永法，方富贵，张运海，刘亚，李运生，
申请(专利权)人：临泉县现代农业技术合作推广服务中心安徽农业大学新农村发展研究院皖西北综合试验站临泉县中原牧业发展中心，
类型：发明
国别省市：