一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白及其突变体和应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白及其突变体和应用。本发明专利技术就如何提高yCD催化活性开展相关研究，以筛选到高催化活性的yCD突变体，有利于填补提高yCD催化活性的数据断层，为5

【技术实现步骤摘要】
一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白及其突变体和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白及其突变体和应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]世界卫生组织公布的数据显示，目前，癌症已经成为危害人类健康的重要原因，2019年，美国用于癌症治疗方面的花费就高达210亿美元。随着人口老龄化的加剧，癌症发病率已经呈逐年上升的趋势，巨额的癌症治疗费用必将加剧国家财政支出和个人经济负担，因此，开展癌症治疗领域的相关研究显得尤为重要。
[0004]酵母胞嘧啶脱氨酶/5
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氟胞嘧啶(yCD/5
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FC)策略是一种基因导向酶促前药治疗策略，在癌症治疗方面发挥着巨大的潜力，它能够催化无毒前药5
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FC生成化疗药物5
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氟尿嘧啶(5
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FU)，其反应式如图1所示。目前，该策略已经在多种癌症模型以及细胞水平实验中取得了令人鼓舞的实验结果。Korkegian等人通过计算机设计的方法获得了一株yCD的突变体，该突变体既保留了yCD的催化活性，又提高了yCD的热稳定性，目前已经处于三期临床阶段；刘福生等人将yCD/5
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FC策略和溶瘤病毒策略相结合，提出了一种用于治疗和减缓葡萄膜黑色素瘤的制剂，结果表明，两种策略联合使用能够显著地减少葡萄膜黑色素瘤的体积并改善受试者生存期。在户田正博等人申请的国际专利中，该系统也因其小分子药物易于浸入癌症组织的特点，而被用于脑肿瘤的治疗。yCD/5
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FC策略除了优良的实验表现外，还有着区别于传统的癌症治疗方法明显的优势：首先，该策略以无毒的5
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FC作为前药，只在局部才转化为5
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FU，从而极大地减少了治疗过程中正常身体组织的毒副作用；其次，当药物输送至病灶时，其催化产生的小分子5
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FU也能够借助旁观者效应，高效地渗透至患处其他细胞中参与治疗过程，从而极大地降低了药物治疗的剂量，节约了治疗成本。
[0005]虽然，yCD/5
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FC策略在基础研究阶段表现出了明显的优势和巨大的潜力，但是，目前仍无法有效的应用于临床治疗，其中一个较为重要的原因是yCD本身催化效率不理想。为了加速其临床应用进程，科学家也尝试运用不同的方法提高其催化效率，如Warren通过定点饱和突变的方法，将yCD全部氨基酸位点进行饱和突变，但未筛选到活性明显提高的突变体。究其原因，可能是因为yCD已经处于胞嘧啶脱氨酶的进化序列前端，其表现出来的催化活性和底物亲和能力已经明显优于其他来源的胞嘧啶脱氨酶，因此，如何进一步提高yCD催化活性，以突破催化反应速度壁垒，是现阶段亟待解决的问题。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白及其突变体和应用。本专利技术就如何提高yCD催化活性开展相关研究，以筛选到高催化活性的
yCD突变体，有利于填补提高yCD催化活性的数据断层，为5
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FC/yCD系统在癌症治疗领域的全面应用提供相关的研究基础，为5
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FC/yCD系统的临床应用提供更优良的备选，加速癌症靶向治疗的临床应用进程。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术是通过如下的技术方案来实现：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，通过将酵母胞嘧啶脱氨酶和高电荷α
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螺旋结构域(Highly charged singleα
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helix，SAH)直接连接或通过一个或多个氨基酸连接获得，所述酵母胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述高电荷α
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螺旋结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]进一步地，所述酵母胞嘧啶脱氨酶源于包括但不限于酿酒酵母或大肠杆菌的其他蛋白体系，所述高电荷α
‑
螺旋结构域源于包括但不限于肌球蛋白、肌凝蛋白、蛋白激酶或高尔基体复合结构的其他α
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螺旋结构。
[0010]进一步地，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白包括将酵母胞嘧啶脱氨酶的C末端通过直接或通过一个或多个氨基酸连接的方式与不同长度的高电荷α
‑
螺旋结构域相连所获得的融合蛋白。
[0011]进一步地，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白包括SEQ ID NO.3所示的yCD
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SAH、SEQ ID NO.5所示的yCD
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RIELQ
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SAH、SEQ ID NO.6所示的yCD
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RIELQ、SEQ ID NO.7所示的yCD
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RIELQ
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1/8SAH、SEQ ID NO.8所示的yCD
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RIELQ
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1/4SAH、SEQ ID NO.9所示的yCD
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RIELQ
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1/2SAH和SEQ ID NO.10所示的yCD
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RIELQ
‑
3/4SAH。
[0012]进一步地，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白还包括与yCD
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RIELQ
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SAH相比具有至少50％同一性的氨基酸序列。
[0013]第二方面，本专利技术提供了一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体，与第一方面所述的yCD
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RIELQ
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SAH相比突变位点位于R159、I160、E161、L162、Q163中的一个或几个氨基酸位点。
[0014]进一步地，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体的突变形式包括保守取代形式、增加和缺失一个和几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式中的一种或多种。
[0015]第三方面，本专利技术提供了一种药物组合物，包括至少一种第一方面所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白和/或至少一种第二方面所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体和至少一种药学可接受的载剂或赋形剂。
[0016]第四方面，本专利技术提供了第一方面所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白和/或第二方面所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白突变体和/或第三方面所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0017]进一步地，所述药物还包括5
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氟尿嘧啶的前药，所述5
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氟尿嘧啶的前药选自由5
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氟胞嘧啶、Toca FC、5
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FC类似物、以及5
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氟胞嘧啶、Toca FC、5
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FC类似物的光活化性化合物、盐或酯组成的组。
[0018]上述本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，其特征在于，通过将酵母胞嘧啶脱氨酶和高电荷α
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螺旋结构域直接连接或通过一个或多个氨基酸连接获得，所述酵母胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述高电荷α
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螺旋结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.如权利要求1所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，其特征在于，所述酵母胞嘧啶脱氨酶源于包括但不限于酿酒酵母或大肠杆菌的其他蛋白体系，所述高电荷α
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螺旋结构域源于包括但不限于肌球蛋白、肌凝蛋白、蛋白激酶或高尔基体复合结构的其他α
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螺旋结构。3.如权利要求1所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，其特征在于，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白包括将酵母胞嘧啶脱氨酶的C末端通过直接或通过一个或多个氨基酸连接的方式与不同长度的高电荷α
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螺旋结构域相连所获得的融合蛋白。4.如权利要求3所述的酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，其特征在于，所述酵母胞嘧啶脱氨酶融合蛋白包括SEQ ID NO.3所示的yCD
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SAH、SEQ ID NO.5所示的yCD
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RIELQ
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SAH、SEQ ID NO.6所示的yCD
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RIELQ、SEQ ID NO.7所示的yCD
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RIELQ
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1/8SAH、SEQ IDNO.8所示的yCD
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RIELQ
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1/4SAH、SEQ ID NO.9所示的yCD
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RIELQ
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1/2SAH和SEQ ID NO.10所示的yCD
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RI...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚礼山，邓涵中，王业飞，秦鸣铭，宋乡飞，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：