【技术实现步骤摘要】
本申请涉及益生菌质量检测方法，具体公开了一种基于单细胞拉曼技术的一体化益生菌质检方法。
技术介绍
1、益生菌被定义为：当给予足够量时，对宿主健康有益的活的微生物。益生菌的摄入可以促进肠道微生物群的生长，并增强人体的自然防御系统。因此，益生菌被广泛添加于酸奶、麦片、婴儿奶粉等食品中。此外，益生菌还可用于治疗儿童急性腹泻、缓解肠易激综合征、根除幽门螺旋杆菌感染和预防特应性皮炎。近年来，随着益生菌概念的流行，益生菌的产品线已经从饮食补充剂扩展到临床治疗。对于益生菌，不同菌株的细胞数量和组成的准确性是公众主要关心的问题。但是，许多商业化益生菌产品的质量令人担忧，许多商品的说明书上并未标注关于所含益生菌菌株的功效和产品中实际存在的活细胞数量(菌落形成单位[cfu/毫升])。因此，为规范愈发庞大的益生菌市场，对商业益生菌产品进行包括快速原位活力测试、菌株鉴定和单细胞全基因图谱绘制在内的定性和定量评估，对于提高发酵食品行业的整体质量尤为重要。然而，目前行业中广泛应用的方法有很大的局限性。
2、首先，对于益生菌产品的“原位活力”方面，存在足够的活细胞数是保证产品质量的关键指标。《益生菌类保健食品申报与审评规定（试行）》（2005年）和《益生菌类保健食品申报与审评规定（征求意见稿）》（2019年）规定，在保质期内的益生菌产品，活细胞数不得低于107cfu/ml（g）。然而，活细胞计数的传统方法仍然依赖培养，例如平板计数法和琼脂扩散法，这些方法的灵敏性相对较差，且较为耗时。此外，在目标益生菌的活力较差或密度较低时，应用平板计数法可能无法
3、其次，正确识别益生菌菌株是评估其益生菌安全性的先决条件之一。目前，识别不同益生菌菌株的常用方法主要分为基因型分析和表型分析两种。其中，基因型分析包括许多基于dna的方法，例如与传统选择性培养技术相结合的全基因组测序、16s rrna基因测序、管家基因等。然而，这些方法都是耗时、高成本和依赖培养的，这限制了其检测不可培养细胞的应用。宏基因组测序方法可以分析部分或完全无法在选择性生长培养基上生长的益生菌产品的成分。然而，它的高成本和无法区分死活细胞限制了它的广泛应用。除此之外，还有基于表型分析的方法，包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱、傅里叶变换红外光谱和串联质谱等。然而，它们成本高昂，依赖于培养，并且无法区分活菌和死菌。总之，上述所有方法不仅成本高、耗时费力，而且依赖于培养基于以上现状，我们急需一种快速、低成本且可靠的益生菌菌株识别方法。
4、拉曼光谱技术作为一种无标记的生化指纹技术，能够揭示单个细胞的内在化学信息，对单细胞研究具有很大的潜力。此外，拉曼光谱与单细胞操作技术（包括液体溶液中的微流控、微液滴、光镊技术以及芯片上的激光喷射技术）相结合，可以实现对目标细胞的分选，即拉曼激活细胞分选技术（raman activated cell sorting, racs）。
5、单细胞拉曼光谱可对单个微生物细胞进行检测，无须培养。它可以快速无损地获取细胞内不同生物分子的振动光谱，包括核酸、蛋白质、脂类、色素（如细胞色素c和类胡萝卜素） 和聚合物等。通过这些谱图的变化鉴别微生物细胞的生理性状和应激响应等信息。更重要的是，拉曼光谱还可与13c、15n或2d等稳定同位素标记（sip） 结合，提供真实的微生物功能和代谢活性等信息。它利用活性细胞同化同位素标记底物后，新合成生物分子化学键中的氢原子被重同位素取代，造成化学键振动频率下降，拉曼峰发生偏移。该拉曼峰偏移，可作为微生物功能或活性的标志峰。例如，利用重水同位素标记时，活性微生物同化氘并代替氢进行合成代谢，使得构成生命体的重要生物分子，如脂类、蛋白质、dna等被氘化，所产生的新的c-d键可被拉曼光谱灵敏检测到，并且c-d峰强度还可反映微生物的新陈代谢活性。
6、为解决益生菌质量检测存在的以上技术问题，并基于拉曼光谱单细胞检测方面的原理，本专利技术提供一种基于单细胞拉曼技术的益生菌检测方法。
技术实现思路
1、本申请所说的cnn模型为卷积神经网络模型，将待测菌拉曼光谱与标准菌株的拉曼光谱进行比对、预测，鉴定出待测菌株菌种。
2、本申请所说的scrs数据库为单细胞拉曼光谱数据库。
3、本申请所说的scracs-seq仪器为单细胞拉曼分选耦合测序仪。
4、本申请所说的cd-ratio值为c-d键（2040-2300 cm−1）的光谱强度除以c-d键和c-h键（2800-3100 cm−1）的光谱强度之和，即碳-氘峰值占比，本申请cdr为cd-ratio的简写。
5、本申请的mrs为市售mrs培养基。
6、本申请所说的bs为市售bs琼脂培养基。
7、本申请定义mal值作为评价益生菌产品的原位活力的指标，，mal值越高，则活力越高。如果细胞的mal≤0，被认为是死细胞; 如果细胞的mal>0, 则被认为是活细胞。
8、本申请所说rmal值是指相对代谢活性，即所测样本的原位活性与样本中的原始菌株在对数期（12h）的代谢活性的比值，rmal =（cdr_样本-cdr_0h）÷（cdr_原始菌株-cdr_0h），这里所说的cdr原始菌株是益生菌产品中的原始纯菌株的对数生长期（12小时）取样，然后在100%d2o孵育3小时的平均cdr值。
9、本申请所说的偏差为标准偏差。
10、本申请每1μl待测菌液涂布视野格数为660个。
11、本申请每次计数选取左上，右上，左下，右下和中间5个方格。
12、本申请每个待测菌液样本三个平行样取平均值。
13、本申请所说的单细胞是指某一株菌的单个细胞。
14、本申请所说的非植物乳杆菌299v是指本申请21种标准文库中除了植物乳杆菌外的其他20种益生菌标准菌株的混合样品。
15、本申请所说的植物乳杆菌299v是植物乳杆菌中的一种，本申请将其称作的植物乳杆菌299v。
16、本申请所说的d2o是两本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于单细胞拉曼技术的益生菌质检方法，该方法包括标准单菌株拉曼光谱数据库的建立、待测菌液制备、待测单菌株拉曼光谱的采集、菌种鉴定、死活菌株计数以及代谢活性检测的步骤，其特征在于：所述待测菌液制备步骤为将待测菌用生理盐水溶解、稀释、用重水培养基培养、去除培养基，调整细胞密度以确保每个细胞完全分散在载玻片上，得到待测菌液。
2.根据权利要求1所述的益生菌质检方法，其特征在于：所述用重水培养基培养的步骤中培养基中重水的浓度为98%-100%，所述浓度为D2O与H2O的百分比。
3.根据权利要求1所述的益生菌质检方法，其特征在于：所述用重水培养基培养的时间为3-4小时。
4.根据权利要求1所述的益生菌质检方法，其特征在于：所述去除培养基为用无菌双蒸水洗涤去除培养基至不干扰检测。
5.根据权利要求1所述的益生菌质检方法，其特征在于：所述调整细胞密度以确保每个细胞完全分散在载玻片上为加入终浓度0.2%±0.05%的吐温20使细胞分散均匀。
6.根据权利要求1所述的益生菌质检方法，其特征在于：所述待测单菌株拉曼光谱采集为取1μL
7.根据权利要求1所述的益生菌质检方法，其特征在于：所述菌种鉴定为利用CNN模型对待测菌拉曼光谱与标准菌株的拉曼光谱进行比对、预测，鉴定出待测菌株菌种。
8.根据权利要求1所述的益生菌质检方法，其特征在于：所述代谢活性检测为通过技术采集到的单细胞拉曼光谱的个数计算细胞总数，并通过MAL值计算活细胞数；所述通过MAL值计算活细胞数为MAL=CDR_样本-CDR_0h，如果MAL≤0，被认为是死细胞，如果细胞的MAL>0，则被认为是活细胞；所述CDR为C-D键的光谱强度除以C-D键和C-H键的光谱强度之和，以量化C-H键中D的替代程度，即碳-氘峰值占比；所述C-D的光谱强度是指在光波长度2040-2300cm−1范围内的光谱强度；所述C-H键的光谱强度是指在光波长度2800-3100 cm−1范围内的光谱强度。
9.根据权利要求1所述的益生菌质检方法，其特征在于：待测单菌株拉曼光谱的采集、菌种鉴定、死活菌株计数以及代谢活性检测的步骤是同时完成的。
...【技术特征摘要】
1.一种基于单细胞拉曼技术的益生菌质检方法，该方法包括标准单菌株拉曼光谱数据库的建立、待测菌液制备、待测单菌株拉曼光谱的采集、菌种鉴定、死活菌株计数以及代谢活性检测的步骤，其特征在于：所述待测菌液制备步骤为将待测菌用生理盐水溶解、稀释、用重水培养基培养、去除培养基，调整细胞密度以确保每个细胞完全分散在载玻片上，得到待测菌液。
2.根据权利要求1所述的益生菌质检方法，其特征在于：所述用重水培养基培养的步骤中培养基中重水的浓度为98%-100%，所述浓度为d2o与h2o的百分比。
3.根据权利要求1所述的益生菌质检方法，其特征在于：所述用重水培养基培养的时间为3-4小时。
4.根据权利要求1所述的益生菌质检方法，其特征在于：所述去除培养基为用无菌双蒸水洗涤去除培养基至不干扰检测。
5.根据权利要求1所述的益生菌质检方法，其特征在于：所述调整细胞密度以确保每个细胞完全分散在载玻片上为加入终浓度0.2%±0.05%的吐温20使细胞分散均匀。
6.根据权利要求1所述的益生菌质检方法，其特征在于：所述待测单菌株拉曼光谱采集为取1μl待测菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：张佳，徐腾，任立辉，王晓航，朱鹏飞，马波，徐健，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：
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