【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化和生物制药，具体涉及新型氨基酰化酶及其序列，以及利用其催化制备手性氨基酸及其衍生物方法。
技术介绍
1、脊髓小脑共济失调是一组以共济失调、辨距不良为主要临床表现的中枢神经系统慢性变性疾病，目前，常用的改善共济失调症状的药物为他替瑞林。2019年，洛瓦替瑞林作为新一代治疗共济失调药物进入了三期临床试验，洛瓦替瑞林是一款促甲状腺激素释放激素类似物，其具有较高的生物利用度，在相同剂量下洛瓦替瑞林的效果是他替瑞林的30倍。在开发洛瓦替瑞林药物的过程中，(s)-2-氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸是其重要的医药中间体，开发绿色经济的(s)-2-氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸合成路线对于洛瓦替瑞林药物的研发具有重要意义。
2、目前，关于该手性中间体高效、特异性、绿色合成的报道较少。专利wo9945000中曾公开了一种以4-甲基噻唑为起始原料，利用生物和化学组合的方法合成(s)-2-氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸的工艺路线。在该工艺路线中，酰基转移酶被用于合成(s)-2-氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸，但是该专利中酰基转移酶的生物来源不明，氨基酸序列未知，具体催化效率未明确。氨基酰化酶能够以酰化氨基酸或其衍生物为底物，对其酰胺键进行立体选择性水解，可用于手性氨基酸及其衍生物的合成。但是，由于不同来源的氨基酰化酶在活性、稳定性、底物选择性和立体选择性上表现不一，这在很大程度上限制了酶法合成(s)-2-氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸的工业化应用。因此，继续寻找催化活性高、立体选择性强且稳定性好的新型氨基酰化酶资源，
技术实现思路
1、针对现有技术中生物酶资源不足、来源不明和特性不清的问题，本专利技术的目的在于提供若干新型氨基酰化酶及其相关序列，并提供利用所述氨基酰化酶高效、绿色、经济、特异性催化合成(s)-2-氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸的技术方法。
2、本专利技术所述方法中，催化剂制备过程简单、成本低廉、反应条件温和、工艺流程短、产物产率高、立体构型纯，具有很高的工业应用潜力。
3、本专利技术提供了一种催化合成(s)-2-氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸的方法，以2-乙酰氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸为底物，所述催化剂含有氨基酰化酶，所述氨基酰化酶包括如seqid no：2、seq id no：4或seq id no：5至少一个序列所示的氨基酸序列。
4、本专利技术所述氨基酰化酶的来源包括并不限于以下优选方法：优选的通过生物工程的方法制备，优选的通过制备表达所述氨基酰化酶的重组菌获得所述催化剂，其中所述氨基酰化酶的编码基因序列优选的通过化学合成的方法制备；获得所述氨基酰化酶的另一个优选方式是通过化学合成的方法制备目标多肽序列，获得所述催化剂。现有技术中能够制备得到氨基酸序列如seq id no：2、seq id no：4或seq id no：5所示的氨基酰化酶的酶制备方法均适用于本专利技术。
5、优选的是，所述催化剂来源于表达所述氨基酰化酶的重组菌，优选的所述催化剂为表达所述氨基酰化酶的重组菌全细胞(本专利技术又称为全细胞催化剂)、粗酶液(本专利技术又称为粗酶液催化剂)、纯酶(本专利技术又称为纯酶催化剂)或干粉酶制剂中的一种。
6、本专利技术提供了一种利用所述氨基酰化酶以重组菌全细胞、粗酶液、纯酶作为催化剂，一步手性拆分底物2-乙酰氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸合成(s)-2-氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸的方法，图1所示为所述的(s)-2-氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸生物催化合成方法。
7、本专利技术所提供的方法氨基酰化酶来源明确，催化剂制备过程简单，成本低廉，反应过程简单、温和、环保，立体选择性高，可以实现转化率理论最大值50％和产品e.e.值99％以上。
8、上述任一项优选的是，表达所述氨基酰化酶的重组菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母中的至少一种。
9、上述任一项优选的是，所述氨基酰化酶的编码序列包括seq id no：8、seq id no：10或seq id no：11至少一项所示的核苷酸序列。
10、本专利技术所述氨基酰化酶来源于细菌、真菌或哺乳动物。所述氨基酰化酶可以使用但不限于以下来源，来源于geobacillus stearothermophilus的n-酰基-l-氨基酸酰胺水解酶(seq id no：1)、来源于dictyosteliumdiscoideum的n-酰基-l-氨基酸酰胺水解酶(seq id no：2)、来源于rhodococcus erythropolis的酰基酰胺酶(seq id no：3)、来源于homo sapiens的n-酰基-芳香-l-氨基酸酰胺水解酶(seq id no：4)、来源于mus musculus的n-酰基-芳香-l-氨基酸酰胺水解酶(seq id no：5)、来源于sus scrofa的n-酰基-l-氨基酸酰胺水解酶(seq id no：6)。
11、本专利技术基于6种氨基酰化酶的氨基酸序列，针对宿主菌(以大肠杆菌为例)密码子使用偏好，对氨基酰化酶的编码序列进行dna序列优化，并合成相应的基因片段(seq idno：7至seq id no：12)。将合成的基因通过标准基因克隆法克隆至大肠杆菌表达载体pet-28b(+)中，将重组后的质粒导入escherichia coli bl21(de3)菌株。利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导重组菌中氨基酰化酶的表达。直接通过离心收集细胞湿菌体，获得具备催化活性的氨基酰化酶重组菌细胞用做所述反应的全细胞催化剂；或经过细胞破碎获得具备催化活性的氨基酰化酶重组菌细胞裂解液用做所述反应的粗酶液催化剂；或通过镍柱亲和层析纯化获得纯化的氨基酰化酶用做所述反应的纯酶催化剂。
12、适用于本专利技术的异源表达宿主菌，包括但不限于常用的异源表达微生物体系，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母等。
13、上述任一项优选的是，所述全细胞催化剂优选为诱导完毕后通过离心分离获得的新鲜湿菌体，或优选为在低温下(如-80℃～-20℃)保存的上述湿菌体，或优选为脱水干燥后的全细胞干粉。
14、上述任一项优选的是，所述粗酶液催化剂优选为细胞经过超声破碎或高压破碎后离心直接获取的粗酶液，或优选为在低温下(如-80℃～-20℃)保存的上述粗酶液，或优选为脱水干燥后的粗酶干粉。
15、上述任一项优选的是，所述纯酶催化剂优选为上述获得的粗酶液经过镍柱亲和层析纯化后直接获取的纯酶，或优选为在低温下(如-80℃～-20℃)保存的上述纯酶，或优选为脱水干燥后的纯酶干粉。
16、上述任一项优选的是，将所述底物溶解于缓冲体系中，加入所述催化剂，在25-42℃条件下振荡反应。优选的，反应完毕，通过95℃加热20min终止反应。
17、上述任一项优选的是，所述催化反应温度本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种催化合成(S)-2-氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸的方法，以2-乙酰氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸为底物，其特征在于，所述催化剂含有氨基酰化酶，所述氨基酰化酶包括如SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5至少一个序列所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化剂为表达所述氨基酰化酶的重组菌全细胞、粗酶液、纯酶或干粉酶制剂中的至少一种。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，表达所述氨基酰化酶的重组菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母中的至少一种。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氨基酰化酶的编码序列包括SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11至少一项所示的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述底物溶解于缓冲体系中，加入所述催化剂，在25-42℃条件下振荡反应；反应完毕，通过95℃加热20min终止反应。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系pH7.0-pH8.0。<...
【技术特征摘要】
1.一种催化合成(s)-2-氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸的方法，以2-乙酰氨基-3-(噻唑-4-基)丙酸为底物，其特征在于，所述催化剂含有氨基酰化酶，所述氨基酰化酶包括如seq idno：2、seq id no：4或seq id no：5至少一个序列所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化剂为表达所述氨基酰化酶的重组菌全细胞、粗酶液、纯酶或干粉酶制剂中的至少一种。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，表达所述氨基酰化酶的重组菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母中的至少一种。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氨基酰化酶的编码序列包括seq id no：8、seq id no：10或seq id no：11至少一项所示的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述底物溶解于缓冲体系中，加入所述催化剂，在25-42℃条件下振荡反应；反应完毕，通过95℃加热20min终止反应。
6.如权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕雪峰，曹艳丽，徐卉芳，罗泉，杨亮，周冠，董江鹏，徐扬军，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：
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