白细胞介素2结合分子、其衍生物、试剂盒及其生产方法和用途技术

本发明专利技术公开了白细胞介素2结合分子，其能够特异性结合白细胞介素2，且包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述的至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含CDR1、CDR2和CDR3；其中CDR1包含与SEQ ID NO:1‑15中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR2包含与SEQ ID NO:16‑54中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR3包含与SEQ ID NO:55‑84中任一项中至少90％相同的氨基酸序列。本发明专利技术还公开了其编码的核酸分子、表达载体、宿主细胞、生产方法，应用其的免疫缀合物、药物组合物、试剂盒，以及其用途。本发明专利技术通过筛选得到具有高特异性、高亲和力和高稳定性的白细胞介素2结合分子，以用于治疗、预防和诊断IL2相关疾病。

【技术实现步骤摘要】
白细胞介素2结合分子、其衍生物、试剂盒及其生产方法和用途
本专利技术涉及生物医药
，尤其是一种针对白细胞介素2(IL2)的单域抗体。
技术介绍
白细胞介素2(interleukin2，IL2)从被发现迄今已有30余年，但仍然是最受关注和被广泛研究的细胞因子之一。人体内IL2为分子量15.5kDa的糖蛋白，成熟的IL2分子有153个氨基酸肽链N端剪掉20个氨基酸残基的信号肽后剩下的133个氨基酸残基组成，IL2与其他细胞因子在序列上无同源性(TTaniguchi,HMatsui,TFujita,CTakaoka,NKashima,RYoshimoto,JHamuro.StructureandexpressionofaclonedcDNAforhumaninterleukin-2.Nature.1983Mar24-30；302(5906):305-10.)。在稳定状态下，IL2主要是由二级淋巴器官里的CD4+T辅助细胞产生，少部分是由CD8+T细胞、NK细胞和NKT细胞产生，抗原刺激能强烈诱导CD4+和CD8+T细胞产生，尽管CD8+T细胞合成IL2能力较弱，而且这些细胞的应答往往需要CD4+T细胞的帮助(参考文献：ThomasRMalek.Thebiologyofinterleukin-2.AnnuRevImmunol.2008；26:453-79.)。IL2作为153个氨基酸的前体蛋白合成，前20个氨基末端氨基酸作为疏水分泌信号序列。该蛋白质包含对生物活性至关重要的单个二硫键(连接位置Cys58/105)。IL2的生物活性由膜受体介导，所述膜受体几乎专门在活化的T细胞上表达，而不在静息T细胞上表达。完整的IL2受体由3个I型穿膜蛋白亚基构成：α、β和γ；较低亲和性的功能性受体可以仅由β和γ受体蛋白组成。静息的B细胞和静息的单核白细胞很少表达该受体。IL2受体(尤其是α亚基)的表达由许多因子调节，例如有IL5、IL6和L2R/p55诱导因子。小鼠和人IL2都能使同种物种T细胞高效增殖。人IL2对小鼠细胞也有作用，但反之不然。IL2是所有T淋巴细胞亚群的生长因子。它对于T细胞来说，是抗原非特异性的增殖因子，其能诱导静息的细胞中的细胞周期进程并由此使T淋巴细胞克隆扩增。IL2也促进活化的B细胞的增殖和分化。与T细胞的增殖一样，该活性也需要存在其他因子，例如IL4。IL2通过作用于细胞膜上的IL2R来发挥其生物活性。IL2R是一个复合体，由CD25(IL2Rα链，55kd)、CD122(IL2Rβ链，75kd)和CD132(IL2Rγ链，64kd)组成，只表达α的细胞以低亲和力与IL2结合，且无法进行细胞内信号转导，当α链与β链与γ链共同构成三聚体型IL2R时，可以将IL2R与IL2结合的亲和力提高10～100倍(Kd≈10-11)，β和γ都属于Ⅰ型细胞因子受体家族，γ亚基不单独与IL2结合，但与β亚基结合可构成低亲和力二聚体型IL2R(Kd≈10-9)，共同成为IL2R信号的组成部分。β和γ亚基在它们胞质内的尾部都携带信号序列，其信号转导通过多种细胞内通路，如酪氨酸蛋白激酶-信号转导和转录因子激活通路(JAK/STAT)、磷脂酰肌醇-3激酶B通路(PI3K/Akt)及丝裂原活化蛋白激酶通路(MAPKs)(参考文献：JXLin,WJLeonard.SignalingfromtheIL-2receptortothenucleus.CytokineGrowthFactorRev.1997Dec；8(4):313-32.)。IL-2作为恶性肿瘤免疫治疗的一部分，在临床上已经被广泛应用30多年，但其作用受到毒性、体内不稳定性以及抑制性Treg细胞而非效应T细胞的优先扩张等因素的限制。在机制上，IL2最初与IL-2Rα结合，导致IL-2的构象改变，从而使其有效地与IL-2Rβ和IL-2Rγ，然后形成高亲和力的受体激活细胞内信号通路。当IL2与中等亲和受体，IL-2Rβ和IL-2Rγ二聚体相互作用时，也可激活细胞内信号通路。IL-2Rα在Treg细胞有广泛的表达，但Treg细胞不具有杀伤作用，导致IL-2被消耗掉，而没有产生很好的细胞杀伤作用。单结构域抗体(sdAb)是由单个单体可变抗体域组成的抗体。像整个抗体一样，它能够选择性结合特定的抗原。单结构域抗体比由两条蛋白重链和两条轻链组成的常见抗体小得多。第一个单结构域抗体是由骆驼科动物中发现的重链抗体改造而来的(参考文献：Hamers-CastermanC，AtarhouchT，MuyldermansS，RobinsonG，HamersC，SongaEB，BendahmanN，HamersR(1993)Naturallyoccurringantibodiesdevoidoflightchains.Nature363(6428):446–448.)。目前，对单结构域抗体的大多数研究基于重链可变结构域。单结构域抗体具有许多优点。例如，它们通常表现出高溶解度和稳定性，并且还可以容易地在酵母、植物和哺乳动物细胞中产生(参考文献：HarmsenMM，DeHaardHJ(2007)Properties，production，andapplicationsofcamelidsingle-domainantibodyfragments.ApplMicrobiolBiotechnol77(1):13–22.)。此外，它们具有良好的热稳定性和良好的组织渗透性。而且它们还在生产中具有成本效益。虽然已开发出针对IL2的抗体，但作为治疗剂仍有改善抗IL2抗体的需要。此外，值得注意的是，目前针对IL2的单结构域抗体很少。因此，本领域希望开发新的抗IL2抗体，特别是针对IL2的单结构域抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用噬菌体展示技术，通过筛选得到具有高特异性、高亲和力和高稳定性的白细胞介素2结合分子，以用于治疗、预防和诊断IL2相关疾病，本专利技术的目的还在于提供编码白细胞介素2的核酸分子，表达抗白细胞介素2的表达载体和宿主细胞，以用于生产，便于实现临床应用。本专利技术采用以下技术方案：本专利技术公开了白细胞介素2结合分子，其能够特异性结合白细胞介素2，且包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述的至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含CDR1、CDR2和CDR3；其中CDR1包含与SEQIDNO:1-15中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR2包含与SEQIDNO:16-54中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR3包含与SEQIDNO:55-84中任一项中至少90％相同的氨基酸序列。优选地，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含选自表1的CDR1、CDR2和CDR3。其中，所述的免疫球蛋白单一可变结构域是VHH，所述的VHH包含与SEQIDNO:85-138中任一序列具有至少80％序列相同的氨基酸序列。进一步地，所述的白细胞介素2结合分子，与白细胞介素2结合的KD值小于1×10-7M。其中，本专利技术白细胞介素2结合分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.白细胞介素2结合分子，其特征在于：其能够特异性结合白细胞介素2，且包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述的至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含CDR1、CDR2和CDR3；其中CDR1包含与SEQ ID NO:1-15中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR2包含与SEQ ID NO:16-54中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR3包含与SEQ IDNO:55-84中任一项中至少90％相同的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.白细胞介素2结合分子，其特征在于：其能够特异性结合白细胞介素2，且包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述的至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含CDR1、CDR2和CDR3；其中CDR1包含与SEQIDNO:1-15中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR2包含与SEQIDNO:16-54中任一项中至少90％相同的氨基酸序列，CDR3包含与SEQIDNO:55-84中任一项中至少90％相同的氨基酸序列。


2.如权利要求1所述的白细胞介素2结合分子，其特征在于：所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：
(1)SEQID:7所示的CDR1，SEQID:21所示的CDR2，SEQID:59所示的CDR3；
(2)SEQID:4所示的CDR1，SEQID:18所示的CDR2，SEQID:58所示的CDR3；
(3)SEQID:13所示的CDR1，SEQID:30所示的CDR2，SEQID:63所示的CDR3；
(4)SEQID:2所示的CDR1，SEQID:18所示的CDR2，SEQID:55所示的CDR3；
(5)SEQID:1所示的CDR1，SEQID:18所示的CDR2，SEQID:55所示的CDR3；
(6)SEQID:7所示的CDR1，SEQID:20所示的CDR2，SEQID:59所示的CDR3；
(7)SEQID:1所示的CDR1，SEQID:25所示的CDR2，SEQID:55所示的CDR3；
(8)SEQID:9所示的CDR1，SEQID:33所示的CDR2，SEQID:62所示的CDR3；
(9)SEQID:1所示的CDR1，SEQID:18所示的CDR2，SEQID:57所示的CDR3；
(10)SEQID:1所示的CDR1，SEQID:45所示的CDR2，SEQID:68所示的CDR3；
(11)SEQID:7所示的CDR1，SEQID:20所示的CDR2，SEQID:80所示的CDR3；
(12)SEQID:2所示的CDR1，SEQID:16所示的CDR2，SEQID:55所示的CDR3；
(13)SEQID:3所示的CDR1，SEQID:51所示的CDR2，SEQID:56所示的CDR3；
(14)SEQID:6所示的CDR1，SEQID:23所示的CDR2，SEQID:61所示的CDR3；
(15)SEQID:2所示的CDR1，SEQID:18所示的CDR2，SEQID:58所示的CDR3；
(16)SEQID:3所示的CDR1，SEQID:50所示的CDR2，SEQID:56所示的CDR3；
(17)SEQID:14所示的CDR1，SEQID:41所示的CDR2，SEQID:78所示的CDR3；
(18)SEQID:2所示的CDR1，SEQID:39所示的CDR2，SEQID:55所示的CDR3；
(19)SEQID:4所示的CDR1，SEQID:40所示的CDR2，SEQID:58所示的CDR3；
(20)SEQID:12所示的CDR1，SEQID:34所示的CDR2，SEQID:69所示的CDR3；
(21)SEQID:4所示的CDR1，SEQID:18所示的CDR2，SEQID:67所示的CDR3；
(22)SEQID:9所示的CDR1，SEQID:32所示的CDR2，SEQID:62所示的CDR3；
(23)SEQID:1所示的CDR1，SEQID:35所示的CDR2，SEQID:71所示的CDR3；
(24)SEQID:1所示的CDR1，SEQID:43所示的CDR2，SEQID:64所示的CDR3；
(25)SEQID:3所示的CDR1，SEQID:54所示的CDR2，SEQID:56所示的CDR3；
(26)SEQID:15所示的CDR1，SEQID:37所示的CDR2，SEQID:57所示的CDR3；
(27)SEQID:3所示的CDR1，SEQID:53所示的CDR2，SEQID:56所示的CDR3；
(28)SEQID:1所示的CDR1，SEQID:31所示的CDR2，SEQID:65所示的CDR3；
(29)SEQID:4所示的CDR1，SEQID:27所示的CDR2，SEQID:70所示的CDR3；
(30)SEQID:2所示的CDR1，SEQID:29所示的CDR2，SEQID:73所示的CDR3；
(31)SEQID:10所示的CDR1，SEQID:28所示的CDR2，SEQID:66所示的CDR3；
(32)SEQID:8所示的CDR1，SEQID:42所示的CDR2，SEQID:82所示的CDR3；
(33)SEQID:8所示的CDR1，SEQID:44所示的CDR2，SEQID:81所示的CDR3；
(34)SEQID:2所示的CDR1，SEQID:17所示的CDR2，SEQID:57所示的CDR3；
(35)SEQID:8所示的CDR1，SEQID:46所示的CDR2，SEQID:83所示的CDR3；
(36)SEQID:1所示的CDR1，SEQID:16所示的CDR2，SEQID:55所示的CDR3；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁耀极，刘杰，陈莹，陈滨滨，
申请(专利权)人：厦门柏慈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35