胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法技术

本发明专利技术涉及胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法。具体涉及用于传代培养胎盘间充质干细胞的培养基，其是以DMEM‑F12培养基为基质配制并包含：血小板裂解物、人血白蛋白、重组胰岛素、EGF等等。分离和传代培养胎盘间充质干细胞的方法包括(a)分离培养原代胎盘间充质干细胞和(b)传代培养胎盘间充质干细胞两个阶段，其中在分离培养原代胎盘间充质干细胞的阶段使用原代完全培养基培养得到原代胎盘间充质干细胞，P0代及后续的代次使用传代完全培养基培养细胞得到P1至P10代的间充质干细胞。本发明专利技术方法呈现如说明书所述优异效果，尤其是通过使用无血清的培养基获得高收率且高活率的间充质干细胞。

【技术实现步骤摘要】
胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法
本专利技术属于生物
，涉及一种从胎盘中分离和传代胎盘间充质干细胞的方法。本专利技术还涉及上述胎盘间充质干细胞培养中所用的培养基及相关试液，还涉及无血清培养基在分离和传代胎盘间充质干细胞中的用途。使用本专利技术方法分离培养所述胎盘间充质干细胞时，能够呈现本专利技术所述优异技术效果。特别是，本专利技术涉及使用无血清的培养基从胎盘中分离培养间充质干细胞的方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(CaplanAI.Mesenchymalstemcells.JOrthopRes.1991,9:641-650.PittengerMF,MackayAM,BeckSC,etal.Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。干细胞是人体细胞的祖先，我们体内的所有细胞均来自于干细胞。当体内的细胞衰老死亡或者损伤变性时，干细胞就会生长和转变出可以替代它们的细胞。作为种子细胞，临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。人间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4～7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。间充质干细胞的分离培养以及传代培养工艺是关系到干细胞作为治疗药物使用安全性的关键步骤。培养工艺中尤其是培养基的成分是主要的影响参数。在已有的文献记载的方法中，对间充质干细胞进行分离培养和传代培养时，所用的培养基多需要添加血清，例如胎牛血清，特别是通常需要添加10％胎牛血清，例如通常采用MSC完全培养基(其为包含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基)对间充质干细胞进行分离和培养传代。然而，一方面，胎牛血清的成本相当高，这对于间充质干细胞的培养是不利的；另一方面，胎牛血清作为一种动物来源的外源性物质，其存在于干细胞中会对细胞的临床使用的安全性产生潜在风险。因此，无血清的分离和传代培养间充质干细胞是有意义的。现有的从胎盘中分离干细胞从而建立胎盘干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、工艺复杂、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如，CN101270349A(中国专利申请号200810061267.6)公开了一种胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法，采用收集胎盘母体侧蜕膜组织细胞后，先进行原代细胞的贴壁扩增，再行正、负向免疫分选结合的方法纯化胎盘间充质干细胞，获得CD34－CD105+细胞，在无血清体外培养体系中继代扩增培养。据信该专利技术方法每次只需少量原代细胞(1×105个细胞)就可以达到比较好的分选效果，可进一步提高了胎盘间充质干细胞的纯化率。所用培养体系不但对胎盘间充质干细胞具有明显的扩增优势，并且扩增的细胞具备多分化潜能。可在纯化胎盘间充质干细胞和体外扩增培养中应用。CN101693884A(中国专利申请号200910117522.9)公开了一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法，其工艺步骤为：首先将胎盘、脐带或脂肪组织与细胞保养液按2.5～4∶1的重量比混合放入组织粉碎桶中，粉碎后加入胶原酶混匀，在37℃左右条件下孵育，过滤，加入沉淀剂，静置后吸取上清液，离心，除去上清液，将浓缩的细胞加入到泛影酸钠-聚蔗糖400#的液体上，再离心，收取中间10-15ml的细胞层，用细胞保养液清洗，将收集的细胞计数，检测细胞存活率≥95％时，即可以供临床使用。据信该专利技术不仅实现了从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取所有干细胞，而且实现了工业化生产，使医生在临床上方便、安全、规范地获取成体干细胞，像用药一样地使用成体干细胞治疗病人的疾病，解决临床上很难获取成体干细胞的瓶颈，推广细胞治疗技术。CN102146359A(中国专利申请号201110005964.1)公开了一种从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法。专利技术利用早期流产胎儿胎盘组织提取更原始的人胎盘间充质干细胞，并建立了一种在胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养的体系。据信该专利技术使干细胞的遗传信息及表型更稳定，干细胞特性更原始，并且能有效地扩增细胞，提高产品质量，获得稳定均一的胎盘间充质干细胞，解决了干细胞治疗需要大批量干细胞的问题，可用于多种疾病的治疗。另外，CN102676451A(中国专利申请号201210044648X)公开了一种从胎盘中分离间充质干细胞的方法，该方法包括从胎盘中分离间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(a)取胎盘小叶，用PBS缓冲液充分冲洗，以去除胎盘中残留的血液；(b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消化酶的PBS缓冲液，再在37℃孵育消化；(c)将组织块用铜网过滤，必要时研磨以促使过滤；(d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37℃、5％CO2培养箱中培养；(e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞；以及任选的下列一个或多个步骤：(f)针对步骤(e)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；(g)将步骤(e)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；(h)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(g)的冻存细胞进行关联。据信通过该本专利技术方法可以获得高纯度的胎盘间充质干细胞。这些方法在工艺简便性和/或提取物的纯度和/或回收率方面是有待进一步改善的。另外，本申请的专利技术人团队的专利技术公布CN107299082A(中国专利申请号201710653583.1，公开日2018年1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于传代培养胎盘间充质干细胞的培养基，其是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：2.5％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、8ng/ml的EGF、12ng/ml的bFGF、0.04％硫代甘油、1％果糖。/n

【技术特征摘要】
1.用于传代培养胎盘间充质干细胞的培养基，其是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：2.5％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、8ng/ml的EGF、12ng/ml的bFGF、0.04％硫代甘油、1％果糖。


2.根据权利要求1的培养基，所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL。


3.根据权利要求2的培养基，所述DMEM-F12培养基的配制方法为：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。


4.分离和传代培养胎盘间充质干细胞的方法，其包括(a)分离培养原代胎盘间充质干细胞和(b)传代培养胎盘间充质干细胞两个阶段，其中
(a)分离培养原代胎盘间充质干细胞的阶段包括如下步骤：
(a1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的胎盘样本；
(a2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm2大小，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；
(a3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；
(a4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO2培养箱中培养；
(a5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)；
(b)传代培养胎盘间充质干细胞的阶段包括如下步骤：
(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；
(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培...

【专利技术属性】
技术研发人员：王正，刘冰，肖海蓉，汤乐，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32