一种保持人牙髓干细胞干性的细胞微图案方法技术

本发明专利技术属于细胞培养方法技术领域，设计一种用于保持人牙髓干细胞干性的细胞微图案方法。其包括两种细胞微图案的排列模式：长45微米，宽22.5微米，5000个矩形以上的微图案形成行间距90微米，列间距45微米的矩形微图案阵列和长64微米，宽14微米，5000个以上的矩形微图案形成行间距128微米，列间距28微米的微图案阵列。本发明专利技术用于人牙髓干细胞的细胞培养接种，简单易操作，经过免疫荧光染色细胞干性标记物SOX2和Nanog，从这两个标记物的表达可以证明本发明专利技术可以实现人牙髓干细胞的干性和分化潜能维持，是一种廉价高效的细胞培养方法，有助于临床上组织工程技术的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种保持人牙髓干细胞干性的细胞微图案方法
本专利技术属于细胞培养方法
，是基于组织工程原理，蛋白质微阵列技术以及细胞微图案技术，用于保持人牙髓干细胞的干性和分化能力。
技术介绍
牙周炎是危害人类口腔和全身健康的主要口腔疾病，情况严重会导致牙齿缺失。一旦成人的牙齿出现缺失，临床上常用的治疗方法就仅限于引导性组织再生术、骨移植术等，虽然有一定的疗效，但仍然无法完全恢复牙组织的功能和生理状态。因此，再生和重建具有功能学意义的牙组织，才是彻底治愈牙周炎乃至牙齿缺失的重点。近年来，随着组织工程学的诞生和发展，依赖种子细胞用于牙组织再生，成为目前牙周病学研究的热点。理想的种子细胞必须具有来源丰富、易于分离培养、体外培养及重建过程具有较强的增殖能力并长期维持生理功能及生物活性、能控制分化方向及应用安全等特点。在2000年，Gronthos等科学家首次从成人第三磨牙的牙髓组织中分离培养出一种细胞，它具有克隆性和高度增殖能力，移植到小鼠体内后能形成牙髓/牙本质样结构,具有多向分化能力，因此起名为牙髓干细胞(dentalpulpstemcells，DPSCs)。与BMSCs相比，DPSCs不但取材简单，对机体侵入性小，而且变废为宝，使医疗垃圾获得医学研究价值。随后科学家陆续发现其他多种牙源性干细胞：其中DPSCs因取材丰富、容易培养等优点而受到研究者的青睐，相关研究较多，也是第一个用来治疗临床骨缺损的牙源性干细胞。牙髓干细胞作为特殊的干细胞来源，具有高度增殖和自我更新能力，能在特定条件诱导下分化成多种组织细胞，为组织工程领域的发展寻觅了一条新的途径，展现出良好的应用前景。尽管对牙髓干细胞的研究应用已取得很多的突破，但是主要局限在动物模型上，要想将其成功用于临床组织再生，还存在着诸多问题，其中一个难题就是在体外培养的模型中，牙髓干细胞会逐渐由于不断的更新复制逐渐丧失干性和分化能力，无法继续进行牙周组织的修复重建工作。另一方面，如果考虑使用药物维持牙髓干细胞的细胞功能，其药物副作用对于患者的影响难以评估，考虑到人体组织属于典型的力学-化学耦合体，因此，将生物力学因素引入牙髓干细胞的干性维持领域，对发展牙周组织工程具有重要意义。本专利技术使用将蛋白质微阵列技术和细胞微图案技术结合，使得牙髓干细胞在特定的微图案上能够保持其干性和分化能力，以此扩充牙髓干细胞在临床治疗领域的应用范围。
技术实现思路
本专利技术提供一种新型的细胞微图案排列方法，该方法原理简单，结果高效，可以实现人牙髓干细胞的干性及分化能力的维持，是一种实用性强的牙髓干细胞培养方法。本专利技术通过以下技术方案实现：将纤维粘连蛋白FN按照50微克每毫升的浓度溶解于去离子水中；将FN溶液在带有微图案聚二甲基硅氧烷PDMS印章上孵育，置于37℃恒温细胞培养箱中1小时；(1)孵育完成后将微图案印章置于覆盖PDMS的厚度0.17毫米的盖玻片上，将纤维黏连蛋白从微图案印章上转移至盖玻片上；(2)将人牙髓干细胞按照15000～25000个每平方厘米的密度接种在上述微图案的盖玻片上，得到排列成特殊形状的细胞微图案培养体系。本专利技术包括两种模式：(1)长宽比为1：2的矩形微图案模式(2)长宽比为1：4的矩形微图案模式，其特征是：(1)每种微图案模式的矩形微图案不少于5000个(2)细胞微图案形状按照轴对称和中心对称的模式均匀排列，确保人牙髓干细胞顺利按照微图案的形状生长，每个微图案上有一个人牙髓干细胞贴壁生长。所述两种微图案模式中，长宽比为1：2的矩形微图案模式中微图案的形状为矩形，长45微米，宽22.5微米，5000个矩形以上的微图案形成行间距90微米，列间距45微米的微图案阵列。长宽比为1：4的矩形微图案模式(2)中微图案的形状为矩形，长64微米，宽14微米，5000个以上的矩形微图案形成行间距128微米，列间距28微米的微图案阵列。本专利技术与现有技术手段相比，其主要优点为：(1)本专利技术的细胞微图案方法简便易行，对人牙髓干细胞无任何毒害作用；(2)本专利技术制作成本低廉，便于推广；(3)本专利技术通过细胞微图案将人牙髓干细胞形状固定在面积固定的长宽比为1:2和1:4的矩形抑制了细胞的黏附生长区域，使得细胞维持一种相对静止的状态从而保持干细胞优秀的细胞功能，对组织再生的修复有更好的效果。附图说明附图1长宽比为1：2的矩形微图案模式。附图2长宽比为1：4的矩形微图案模式。附图3免疫荧光染色检测牙髓干细胞的干性标志物Nanog的表达情况，其中Nuclei代表细胞核，F-acin表示细胞骨架，左半部分是普通条件培养的细胞，右半部分是通过本专利技术方式培养的细胞。附图4免疫荧光染色检测牙髓干细胞的干性标志物SOX2的表达情况，其中Nuclei代表细胞核，F-acin表示细胞骨架，左半部分是普通条件培养的细胞，右半部分是通过本专利技术方式培养的细胞。具体实施方式细胞微图案技术简便易行，本专利技术的实现方法具体如下：首先取0.17毫米的玻片，使用紫外清洗机对其表面进行杀菌处理，随后在生物安全柜中使用聚二甲基硅氧烷PDMS微图案印章将上述两种微图案模式的纤维连接蛋白FN修饰在玻片表面，随后将玻片用泊洛沙姆PluronicF-127修饰，隔绝没有被纤维连接蛋白FN修饰的玻片区域。然后将细胞悬液静置于玻片之上，待人牙髓干细胞贴壁生长并且在显微镜下观察到细胞形状和上述微图案形状完全一致后，正常更换培养基进行常规培养，这种培养状态的人牙髓干细胞干性维持能力增强，细胞分化潜能被保留。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种保持人牙髓干细胞干性的细胞微图案方法，包括两种模式：(1)长宽比为1：2的矩形微图案模式(2)长宽比为1：4的矩形微图案模式，其特征是：/n(1)每种微图案模式的矩形微图案不少于5000个；/n(2)细胞微图案形状按照轴对称和中心对称的模式均匀排列，确保人牙髓干细胞顺利按照微图案的形状生长，每个微图案上有一个人牙髓干细胞贴壁生长；/n(3)长宽比为1：2的矩形微图案模式中微图案的形状为矩形，长45微米，宽22.5微米；/n(4)长宽比为1：4的矩形微图案模式(2)中微图案的形状为矩形，长64微米，宽14微米。/n

【技术特征摘要】
1.一种保持人牙髓干细胞干性的细胞微图案方法，包括两种模式：(1)长宽比为1：2的矩形微图案模式(2)长宽比为1：4的矩形微图案模式，其特征是：
(1)每种微图案模式的矩形微图案不少于5000个；
(2)细胞微图案形状按照轴对称和中心对称的模式均匀排列，确保人牙髓干细胞顺利按照微图案的形状生长，每个微图案上有一个人牙髓干细胞贴壁生长；
(3)长宽比为1：2的矩形微图案模式中微图案的形状为矩形，长45微米，宽22.5微米；
(4)长宽比为1：4的矩形微图案模式(2)中微图案的形状为矩形，长64微米，宽14微米。


2.根据权利要求1所述的细胞微图案方法，其特征是，长宽比为1：2的矩形微图案模式(1)5000个矩形以上的微图案形成行间距90微米，列间距45微米的微图案阵列。


3.根据权利要求1所述的细胞微图案方法，其特征是，长宽比为1：4的矩形微图案模式(2)5000个以上的矩形微图案形成行间距128微米，列间距28微米的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑丽沙，李驰宇，郭雨薇，樊瑜波，杨智杰，宋亚欣，纳静，石秋生，
申请(专利权)人：北京航空航天大学，
类型：发明
国别省市：北京;11