一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法技术

本发明专利技术公开了一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法，方法包括：通过食蟹猴皮肤建立纤维细胞系，对纤维细胞进行重编程，获得食蟹猴诱导多能干细胞；根据荧光素酶基因设计引物对，荧光素酶基因与引物对进行PCR反应；限制性内切酶对AAVS1载体质粒和PCR反应产物荧光素酶基因片段进行酶切，T4连接酶连接限制酶切后的产物得到重组AAVS1‑荧光素酶质粒，重组质粒插入食蟹猴诱导多能干细胞中；将获得荧光素酶标记基因的细胞和荧光素底物静脉注射进食蟹猴体内后，放入小动物活体成像仪体内进行荧光成像。采用本方法能够无创、有效监测细胞移植后在体内的存活能力、移动位置、分布情况与增殖情况等一系列生物学变化，为大型动物细胞移植的安全性和有效性提供实时性的参考数据。

A fluorescence tracing method for cynomolgus monkey stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法
本专利技术属于细胞移植
，涉及一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法。
技术介绍
非人灵长类动物模型与人类在基因水平具有高度相似性，其与患者的症状比啮齿类动物模型和其他动物的症状更为接近，这对于理解疾病的机理，探究新的治疗方法的有效性具有巨大潜力。干细胞治疗已被广泛认为是治疗和治愈复杂疾病的一种新型治疗方法，食蟹猕猴多能干细胞(PSC)在形态，基因表达特征和生长特性方面与人多能干细胞相似，但与小鼠多能干细胞存在差异，这表明猕猴可能是回答某些关键问题的最佳模型。传统研究细胞的移植效果主要是通过病理组织切片来进行评估,然而,这种方法不适用于监测细胞在活体内的生物学行为。荧光素与底物反应之后，在大动物体内难以通过小动物活体成像仪观察，本专利使用的荧光素酶是一种高灵敏度的新型荧光素酶，将荧光素酶标记的干细胞注射进食蟹猴体内，可有效的观察到干细胞在食蟹猴体内的分布情况与增殖情况，为临床前干细胞治疗提供参考。生物发光成像技术被应用到细胞示踪领域,不仅可以无创、实时的评价干细胞移植情况,为客观动态评价干细胞在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)通过食蟹猴皮肤建立纤维细胞系，通过重编程小因子对成纤维细胞进行重编程，获得食蟹猴诱导多能干细胞；/n(2)根据荧光素酶基因设计引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R；/n(3)荧光素酶基因与引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R进行PCR反应；/n(4)PCR反应产物进行电泳获得荧光素酶基因片段，然后进行胶回收；使用SalI和MluI限制性内切酶对AAVS1载体质粒和PCR反应产物荧光素酶基因片段进行酶切；/n(5)对酶切后的产物AAVS1-1载体质粒和荧光素酶-1基因片段电泳和胶回收，用T4连接酶连接酶切后的产物AAVS1-1载体...

【技术特征摘要】
1.一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过食蟹猴皮肤建立纤维细胞系，通过重编程小因子对成纤维细胞进行重编程，获得食蟹猴诱导多能干细胞；
(2)根据荧光素酶基因设计引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R；
(3)荧光素酶基因与引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R进行PCR反应；
(4)PCR反应产物进行电泳获得荧光素酶基因片段，然后进行胶回收；使用SalI和MluI限制性内切酶对AAVS1载体质粒和PCR反应产物荧光素酶基因片段进行酶切；
(5)对酶切后的产物AAVS1-1载体质粒和荧光素酶-1基因片段电泳和胶回收，用T4连接酶连接酶切后的产物AAVS1-1载体质粒和荧光素酶-1基因片段，得到重组AAVS1-荧光素酶基因质粒；
(6)将多能干细胞消化成单细胞，再将重组AAVS1-荧光素酶基因质粒与单细胞混合后进行电转；测定核转后的多能干细胞基因序列,确定是否含有荧光素酶基因；电转产物中筛选出荧光素酶标记的细胞，用玻璃针将带有荧光素酶标记的细胞挑出转移到新的培养基中培养，多次传代扩大培养；
(7)麻醉食蟹猴后，将携带荧光素酶基因的多能干细胞消化成单细胞静脉注射进体内后；再注射荧光素底物，将食蟹猴放入小动物活体成像仪体内进行荧光成像。


2.根据权利要求1所述的一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法，其特征在于，所述引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R序列为：
荧光素酶-F:5'-ACGCGTCGACGCCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛昱宇，吴俊模，王芳，李孟佳，
申请(专利权)人：云南中科灵长类生物医学重点实验室，
类型：发明
国别省市：云南;53