本发明专利技术公开了诺西肽生物合成调控蛋白NosP的特异性结合序列及其对诺西肽生物合成效价的影响。具体包括以下内容：构建含有特异性亲和纯化标签和截短nosP基因的重组表达质粒，并在大肠杆菌异源表达和亲和层析法制备NosP蛋白纯品。利用EMSA和DNase Ⅰ footprinting assay技术寻找活跃链霉菌诺西肽生物合成基因簇中的NosP特异性结合序列并验证。在此基础之上，通过诺西肽生物合成途径改造，使诺西肽生物合成效价提高150％，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物次生代谢产物生物合成途径调控领域，具体涉及特异性调控蛋白NosP在硫肽类抗生素诺西肽生物合成基因簇中特异性结合DNA序列的发现和验证，以及通过NosP提高诺西肽在活跃链霉菌中生物合成效价的实际应用。
技术介绍
诺西肽(Nosiheptide)，又称多硫霉素，是由活跃链霉菌(Streptomyces actuosus ATCC 25421)产生的一种典型硫肽类抗生素，是最早被发现并投入使用的硫肽类抗生素之一。诺西肽对革兰氏阳性菌具有广谱而强效的抑制作用，尤其是一些耐药菌如金黄色葡萄球菌具有强力的杀伤作用。但由于其产量低、水溶性差、生物利用度低，目前只作为添加剂被用于动物饲料中[McGinnis C,Poult Sci,1978,57(6):1641-1645.]。诺西肽属于e类硫肽类抗生素，由12个氨基酸及其衍生物组成。它的结构已于1977年被鉴定[Prange T,et al,Nature,1977,265(5590):189-190.]，主要由2部分构成：骨架部分由5个噻唑环，1个吡啶环构成；侧链部分由3-甲基-5-甲氧基-2-吲哚酸构成；骨架部分与侧链之间通过硫脂键相连。链霉菌中抗生素的合成和链霉菌的生长过程密切相关，受到多层次的复杂调控，这些调控途径的核心参与者常为蛋白质类的调控因子，按照调控因子发挥作用的范围可粗略地将其分为2大类：全局性调控因子(global regulator)和途径特异性调控因子(pathway-specific regulator)。对抗生素合成的第一层次的调控来源于全局性调控因子(global regulators)，第二层次的调控来源于途径特异性调控因子。途径特异性调控因子通常位于某种抗生素基因簇中，主要对生物合成基因簇内部基因具有特异性调控作用的调控因子。途径特异性调控因子多数属于SARP(Streptomyces antibiotic regulatory Protein)家族[Wietzorrek A,et al,Mol Microbiol,1997,25(6):1181-1184.]，常充当信号级联系统中的最后一级效应蛋白，专一性地激活一个或几个抗生素基因簇的转录[Martin JF,et al,J Ind Microbiol,1992,9(2):73-90.]，可对抗生素的生物合成效价产生较强的影响。2009年，中科院上海有机所的刘文教授课题组成功钓取并测定了活跃链霉菌(Streptomyces actuosus ATCC 25421)中约35kb的诺西肽生物合成基因簇序列[Pascard C,et al,J Am Chem Soc,1977,99(19):6418-6423.]，为诺西肽生物合成途径的研究创造了便利的条件。生物信息学分析显示，nosP基因位于S.actuosus诺西肽生物合成基因簇一端，推测NosP蛋白属于SARP家族，参与诺西肽生物合成途径特异性调控，但其具体结合的DNA序列以及 对诺西肽生物合成效价的影响均属未知。通常SARP家族途径特异性调控蛋白可通过与生物合成基因簇中特定的DNA序列结合，对抗生素合成相关基因的转录起到重要的调节作用，进而影响抗生素的最终发酵产量。因此NosP结合DNA序列的发现和验证为通过遗传操作技术手段理性改造诺西肽生物合成途径，提高诺西肽生物合成效价提供了理论和物质基础，对增加工业化生产诺西肽的经济性和可行性具有广泛的实用价值和重要意义。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是寻找和验证诺西肽生物合成途径中途径特异性调控蛋白NosP的结合DNA序列，改造诺西肽生物合成基因簇，提高诺西肽的生物合成效价和发酵产量，在此基础之上，通过萃取-结晶方法进一步简化诺西肽生产工艺和降低生产成本。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用了的技术方案包括以下
技术实现思路
：(1)构建含截短nosP基因的重组表达质粒，并在蛋白质的N端或C端添加纯化标签组氨酸标签、GST、MBP中的任意一种，优选组氨酸标签；(2)优化NosP的表达条件：37℃下将工程菌振摇培养至培养液OD600＝0.8±0.1后，加入0.001-2mM的诱导剂IPTG，并优选出最佳浓度0.2mM，在10～37℃下诱导培养8-24h，优选出最佳表达温度和时间分别是16℃和16小时。(3)NosP的纯化制备：采用镍柱亲和层析的方法纯化制备纯度大于95％的NosP蛋白。(4)NosP的特异性结合序列：根据非编码区序列设计合成一系列探针，通过EMSA和DNaseⅠfootprinting assay技术寻找活跃链霉菌诺西肽生物合成基因簇中的NosP特异性结合序列并验证。(5)采用不同方案改造诺西肽生物合成途径，提高诺西肽生物合成效价。本专利技术对诺西肽生物合成途径的调控机制认识具有重要的科学价值和意义，对诺西肽产生菌株理性改造，提高诺西肽发酵效价，降低生产成本具有重要的实际应用价值。附图说明图1NosP蛋白纯化SDS-PAGE图图2NosP蛋白与非编码区标记探针NCRL-M的EMSA实验图具体实施方式以下进一步提供实施实例，这些实施实例有助于理解本专利技术，仅用作说明而不限制 本专利技术的应用范围。实施例1以S.actuosus ATCC 25421基因组为模板，通过PCR扩增5’-端缺少207个碱基的截短nosP基因，并在基因序列上下游分别插入限制性内切酶位点，利用本领域的技术人员熟悉的酶切-连接方法，构建含有不同筛选标记的重组表达质粒：方案1：借助酶切位点NdeI/HindIII和pET22b(+)在NosP的C-端插入组氨酸标签，获得重组质粒为pET22b-his-c；方案2：借助酶切位点NdeⅠ和HindIII在NosP的N-端插入组氨酸标签，获得重组质粒为pET28a-his-n；方案2：借助酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ在NosP的N-端插入GST标签，获得重组质粒为pGEX4T-gst-n.将上述重组质粒测序验证后分别转入E.coli BL21表达宿主中，得到两种基因重组E.coli，按照标签的不同分别称为pHC工程菌、pHN工程菌和pHG工程菌。实施例2将实施例1中得到的三种基因重组E.coli分别在50mL的LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素或50μg/mL卡那霉素)中，37℃、220rpm振摇过夜培养获得相应的种子液。将种子液按5％接种量转接至LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素或50μg/mL卡那霉素)中，37℃振摇培养至培养液OD600＝0.8±0.1时，加入终浓度为0.001-2mM的诱导剂IPTG，在25℃条件下，诱导培养20小时，得到工程菌株E.coli发酵液。在4℃、4500rpm条件下离心15min收集发酵菌体，菌体经40mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤两次，收集菌体用于SDS-PAGE分析。结果发现pHC、pHN和pHG三株工程菌均在0.2mM IPTG条件下获得最佳可溶性表达量，NosP的含量分别占总蛋白量的8.5％本文档来自技高网...
【技术保护点】
诺西肽生物合成调控蛋白NosP的特异性结合序列，其特征在于采用如下方法制备得到，方法包括以下步骤：(1)构建含有nosP基因及相关纯化标签的重组表达质粒并导入大肠杆菌内，异源表达NosP蛋白，并采用亲和层析的方法纯化制备可用于EMSA和DNase Ⅰ footprinting assay的高纯度NosP蛋白；(2)通过EMSA和DNase Ⅰfootprinting assay技术寻找活跃链霉菌诺西肽生物合成基因簇中的NosP特异性结合序列并实验验证。
【技术特征摘要】
1.诺西肽生物合成调控蛋白NosP的特异性结合序列，其特征在于采用如下方法制备得
到，方法包括以下步骤：(1)构建含有nosP基因及相关纯化标签的重组表达质粒并导入大
肠杆菌内，异源表达NosP蛋白，并采用亲和层析的方法纯化制备可用于EMSA和DNase Ⅰ
footprinting assay的高纯度NosP蛋白；(2)通过EMSA和DNase Ⅰfootprinting assay技术
寻找活跃链霉菌诺西肽生物合成基因簇中的NosP特异性结合序列并实验验证。
2.根据权利要求1所述诺西肽生物合成调控蛋白NosP的特异性结合序列，其特征在于，
步骤(1)中所述的表达条件为含重组共表达质粒的工程菌在LB培养基中，37℃下振摇培
养至培养液OD600＝0.8±0.1后，加入0.001-2mM的诱导剂IPTG(优选0.2mM)，在
10～37℃下(优选16℃)诱导培养8-24h(优选16小时)。
3.根据权利要求1所述诺西肽生物合成调控蛋白NosP的特异性结合序列，其特征在于，
步骤(1)中所述的nosP基因是5’-端是去除207个碱基的截短序列SEQ ID NO：1；纯化
标签可以是组氨酸标签、G...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈依军，张红，吴旭日，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。