本发明专利技术提供一种聚羧基甜菜碱基因转染制剂及其制备方法和用途，所述聚羧基甜菜碱基因转染制剂包含基于聚羧基甜菜碱分子的基因转染试剂和待转染的核酸，所述基于聚羧基甜菜碱分子的基因转染试剂包含聚羧基甜菜碱聚合物、复合缓冲液和基因转染工作液。本发明专利技术的基因转染制剂具有优异抗非特异性蛋白吸附性能和高基因转染效率，并具有pH响应性，具有显著的血液稳定性，显著提高了核酸的基因转染效率，可以广泛应用于基因治疗、基因功能、生物制药、药物筛选等诸多研究领域。
【技术实现步骤摘要】
本领域属于基因转染试剂领域，涉及一种聚羧基甜菜碱基因转染制剂及其制备方法和用途。
技术介绍
基因转染是将具有生物功能的核酸分子转运至细胞内的作用位点，并使核酸在细胞内维持其生物功能。由于自由的核酸分子在组织或细胞中易被核酶降解，组织靶向性差，且核酸分子自身带有负电荷，细胞渗透能力差。开发具有选择性、安全性和高效性的基因转染试剂是核酸分子应用的关键。目前，研究和临床应用中常用的载体大致分为病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体因其高效而倍受关注，但其负载量低、特异性不强、安全性差和无法实现大规模生产等缺点，给实际应用带来很大障碍。非病毒载体主要包括阳离子聚合物和阳离子脂质体。阳离子聚合物和阳离子脂质体基因载体相对于病毒载体具有一定优势，然而其负载核酸后表面仍然带有正电荷，血清稳定性差、细胞毒性大、转染效率低，并且其在转染过程中需要更换培养基，操作也比较复杂ο如常用的商售阳离子脂质体基因转染试剂Lipofectamine?2000 (Invitrogen)和聚醚酰亚胺(PEI)具有良好的基因复合能力和内涵体逃逸能力，但是其细胞毒性大(存活率〈50% )，在血清中稳定性不好，因此转染效率也较低，并且在转染过程中需要更换培养基，操作也比较复杂。CN 103194489 A公开了一种新型阳离子脂质体核酸类药物制剂，及其制备方法和应用，所述阳离子脂质体包含阳离子脂质、辅助脂和聚羧基甜菜碱中性脂质和冷冻保护剂。所述阳离子脂质体核酸类药物制剂包含用聚羧基甜菜碱中性脂质修饰的阳离子脂质体和核酸类药物制剂工作液。在该专利中，所述聚羧基甜菜碱成分为聚羧基甜菜碱中性脂质修饰的阳离子脂质体，其必须含有阳离子脂质、辅助脂等成分才能发挥作用，成分比较复杂，制备方法复杂。因此，本领域中需要生物毒性小，在血清中稳定，转染效率更高并且操作简单的基因转染试剂。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种聚羧基甜菜碱基因转染制剂及其制备方法和用途。本专利技术的基因转染制剂具有优异抗非特异性蛋白吸附性能和高基因转染效率，并具有pH响应性，具有显著的血液稳定性，显著提高了核酸的基因转染效率。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案:第一方面，本专利技术提供一种基于聚羧基甜菜碱分子的基因转染试剂，所述基因转染试剂包含聚羧基甜菜碱聚合物、复合缓冲液和基因转染工作液。聚羧基甜菜碱聚合物的每个单体单元侧链都有一个阴离子基团(羧酸根基团)和一个阳离子基团(季胺基团)并且总体表现中性。在酸性条件下，聚羧基甜菜碱分子的阴离子基团(羧酸根基团)可以质子化，使聚羧基甜菜碱带有正电荷，可以利用静电相互作用与负电荷的核酸作用，高效负载核酸分子形成复合物。当复合物恢复生理条件下，聚羧基甜菜碱分子去质子化使复合物表面接近中性，同时可利用阳离子和阴离子基团与水分子的静电相互作用吸附大量水分子，在复合物表面形成水合层，有效抵抗非特异性蛋白质，具有显著的血液稳定性，从而显著提高核酸的基因转染效率。优选地，所述聚羧基甜菜碱聚合物为R_PCBn，所述R为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1，2-油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-十八酰基-sn_甘油(DG)、胆固醇、α -十六烷基丙三醇醚(HGn)、2-溴异丁酸乙酯(EBiB)、1-溴乙基苯(l_PEBr)、2_溴-2-甲二硫代苯甲酸枯酯(CBD)、三硫代碳酸酯(TTC)或二硫代苯甲酸氰基异丙酯(CPDB)中的任意一种，优选为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、2-溴异丁酸乙酯(EBiB)或2-溴-2-甲二硫代苯甲酸枯酯(CBD)中的任意一种，进一步优选为2-溴-2-甲二硫代苯甲酸枯酯(CBD);优选地，所述聚羧基甜菜碱聚合物的聚合度η为1?500的任意整数，例如，聚合度 η 可以为 2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、38、40、44、48、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、480 或 490，优选为 1 ?100 的任意整数，进一步优选为5?50的任意整数，更优选为10?30的任意整数。优选地，所述复合缓冲液为pH值小于7.4的缓冲液，例如pH值为7.2,7.0,6.8、6.5、6.2、6.0、5.8、5.6、5.5、5.2、5.0、4.8、4.5、4.3、4.0、3.7、3.5、3.2、3.0、2.8、2.6、2.4 或2.0的缓冲液，优选为pH值为2?7的缓冲液，进一步优选为pH值为2?6的缓冲液，更优选为pH值为3?5的缓冲液。优选地，所述复合缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液中的任意一种，优选为甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或Tris-盐酸缓冲液中的任意一种，进一步优选为乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或Tris-盐酸缓冲液中的任意一种，更优选为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。优选地，所述基因转染工作液为超纯水、磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为磷酸盐缓冲液(PBS)和/或生理盐水，更优选为生理盐水。优选地，所述聚羧基甜菜碱聚合物:复合缓冲液=lmg: (0.1?100)mL，例如所述聚羧基甜菜碱聚合物:复合缓冲液可以为lmg:0.lmL、lmg:0.3mL、lmg:0.5mL、lmg:0.8mL、lmg:lmL、lmg:1.5mL、lmg:2mL、lmg:3mL、lmg:4mL、lmg:5mL、lmg: 10mL、lmg:20mL、lmg:30mL、lmg:40mL、lmg:50mL、lmg:60mL、lmg:70mL、lmg:80mL、lmg:90mL 或 lmg:100mL，优选为 lmg: (0.5 ?50) mL，更优选为 lmg: (0.5 ?5)mL。优选地，所述复合缓冲液:基因转染工作液=lmL: (0.1?100)mL，例如所述复合缓冲液:基因转染工作液可以为 lmL:0.lmLUmL:0.3mL、lmL:0.5mL、lmL:0.8mL、lmL:lmL、lmL:1.5mL、lmL:2mL、lmL:3mL、lmL:4mL、lmL:5mL、lmL:8mL、lmL: 10mL、lmL:20mL、lmL:30mL、lmL:40mL、lmL:50mL、lmL:60mL、lmL:70mL、lmL:80mL、lmL:90mL 或 lmL:100mL，进一步优选为lmL: (0.1?50) mL，更优选为lmL: (2?10) mL。第二方面，本专利技术提供一种聚羧基甜菜碱基因转染制剂，所述基因转染制剂包含第一方面所述的基因转染试剂和待转染的核酸；优选地，所述基因转染制剂中聚羧基甜菜碱聚合物与待转染的核酸的N/P比为(0.1 ?100):1，例如 0.1:1、0.2:1、0.5:1、0.8:1、1:1、2:1、5:1、8:1、10:1、13:1、15:1、1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于聚羧基甜菜碱分子的基因转染试剂，其特征在于，所述基因转染试剂包含聚羧基甜菜碱聚合物、复合缓冲液和基因转染工作液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张欣，李燕，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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