昆虫DNA甲基转移酶Dnmt1在害虫防治中的应用制造技术

本发明专利技术公开了昆虫DNA甲基转移酶Dnmt1在害虫防治中的应用。本发明专利技术采用瞬时RNAi对斜纹夜蛾和家蚕Dnmt1的研究发现，Dnmt1调控鳞翅目昆虫生长发育，抑制Dnmt1的表达，昆虫出现发育不良、生长缓慢和死亡等症状。基于此，本发明专利技术首次提出可以将抑制Dnmt1表达的抑制剂用于杀虫剂中。本发明专利技术首次发现Dnmt1被干扰后，虫体明显变小，幼虫死亡率增加，但并不是马上全部杀死幼虫。这说明Dnmt1被干扰后虫体生长延缓，不正常，进食减少，可实现对害虫生长、数量的控制，在不影响生态平衡的前提下，达到有效防治害虫的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及昆虫DNA甲基转移酶Dnmt1在鳞翅目害虫防治中的应用。Dnmt1调控昆虫幼虫生长，从而围绕昆虫Dnmt1开展转基因或抑制剂研发，达到害虫防治的目的。
技术介绍
DNA甲基化作为一种普遍存在于真核生物中重要的表观遗传修饰，对生物生长发育的调控具有重要作用。近年来，随着DNA甲基化研究方法的不断改进和创新，特别是大规模测序技术的飞跃发展，使得从整个基因组水平测定和分析甲基化谱成为可能，有关昆虫的甲基化研究取得了一定的进展和成果。已报道的功能主要涉及到调节胚胎发育、基因印迹、翅的分化、性别决定和抗药性形成等，较多的研究报道集中在蜜蜂分化为工蜂和蜂王中其幼虫与成虫的DNA甲基化基因的分析，而作为农业害虫主要所在的鳞翅目昆虫，一直被认为其DNA甲基化率较低，对生长发育的影响不是很重要，仅有的家蚕卵注射DNMTdsRNA的研究报道，也仅是用生物信息学方法分析了一些基因的甲基化率（XiangH,LiX,DaiF,XuX,TanA,ChenL,ZhangG,DingY,LiQ,LianJ,WilldenA,GuoQ,XiaQ,WangJ,WangW.Comparativemethylomicsbetweendomesticatedandwildsilkwormsimpliespossibleepigeneticinfluencesonsilkwormdomestication.BMCGenomics.2013，23;14:646），至今没有该酶影响昆虫表征的研究报道。在细胞中，DNA甲基化由DNA甲基化酶（DNAmethyltransferases，DNMTs）催化完成。DNMTs可依据活性的不同进行分类，在哺乳动物中，DNMTs的作用可分为从头合成甲基化和维系甲基化两类。具初始合成功能的DNA甲基化酶类以DNMT3蛋白质家族为代表，负责基因组中新的甲基化模式的产生，而具维系现状功能的DNA甲基化酶类以DNMT1蛋白质家族为代表，负责复制过程中已有甲基化模式的维系。最近的研究表明DNMT2蛋白质家族作用是对tRNA进行甲基化。Mitsudome等人发现家蚕BmDNMT不仅可以和半甲基化的DNA结合起维持甲基化的作用，也可以和无甲基化的DNA结合，起到从头甲基化的作用，但它与无甲基化DNA的结合效率低于与半甲基化DNA的结合效率。斜纹夜蛾（Spodopteralitura）属鳞翅目夜蛾科斜纹夜蛾属的一个物种。农作物害虫。世界性分布。中国除青海、新疆未明外，各省（自治区）都有发现。幼虫取食甘薯、棉花、芋、莲、田菁、大豆、烟草、甜菜和十字花科和茄科蔬菜等近300种植物的叶片，间歇性猖獗为害。家蚕是大部分农业害虫所属的鳞翅目模式昆虫，对它的研究将指导鳞翅目其他害虫的防治。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供昆虫甲基化转移酶Dnmt1的抑制剂在制备杀虫剂中的应用。本专利技术所采取的技术方案是：昆虫甲基转移酶Dnmt1作为害虫防治靶点的应用。昆虫甲基转移酶Dnmt1的抑制剂在制备杀虫剂中的应用。进一步的，所述Dnmt1的抑制剂为抑制基因Dnmt1表达的物质。进一步的，所述抑制基因Dnmt1表达的物质为基因Dnmt1的RNAi序列。进一步的，所述基因Dnmt1的RNAi序列选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：4中的至少一种。进一步的，所述的昆虫为鳞翅目昆虫。进一步的，所述鳞翅目昆虫为蚕、斜纹夜蛾。进一步的，所述昆虫甲基转移酶Dnmt1的抑制剂为特异性抑制甲基转移酶Dnmt1活性的抑制剂。一种防治虫害的质粒或载体，所述质粒或载体能够表达出特异性抑制或沉默昆虫基因Dnmt1的表达的RNAi序列。一种提高植物防虫害的的方法，通过转基因技术，使植物体内表达能够特异性抑制或沉默昆虫基因Dnmt1表达的RNAi序列。本专利技术的有益效果是：1）Dnmt1是一种甲基转移酶，普遍存在于各种原核及真核动植物。我们采用瞬时RNAi对斜纹夜蛾和家蚕Dnmt1的研究发现，Dnmt1调控鳞翅目昆虫的生长发育，如果幼虫期抑制Dnmt1的表达，昆虫出现发育不良、生长缓慢和死亡等症状。基于此，本专利技术首次提出可以将抑制Dnmt1表达的抑制剂用于杀虫剂的制备中。本专利技术首次发现家蚕和斜纹夜蛾Dnmt1被干扰后，虫体明显变小，幼虫死亡率增加（但并不是马上全部杀死幼虫）。这说明Dnmt1被干扰后虫体生长延缓，不正常，进食减少，可实现对害虫生长、数量的控制，在不影响生态平衡的前提下，达到有效防治害虫的目的。2）本专利技术通过PCR实验发现，家蚕的Dnmt1在其幼虫和变态发育时期皆有表达。基于害虫防治主要在幼虫，我们选择在家蚕五龄幼虫注射Dnmt1dsRNA，结果家蚕发育不良，死亡增加。在斜纹夜蛾幼虫期注射Dnmt1dsRNA，获得了相似的结果。因此开发Dnmt1的抑制剂将可用于害虫防治。附图说明图1为本实施例Dnmt1dsRNA、已报道文献中Dnmt1dsRNA分别与家蚕基BmDnmt1全长cDNA序列的比较，展示两个dsRNA设计片段在全长cDNA的位点是不一样的，序列完全不同；图2为家蚕BmDnmt1在不同发育时期的翅原基（左图）和脂肪体（右图）中mRNA水平分析，其中5L为5龄幼虫、W为游走期、PP为预蛹期、P为蛹期；图3为家蚕五龄第1天注射BmDnmt1dsRNA后48小时的虫体表征；图4为SlDnmt1RNAi后48小时斜纹夜蛾的生长情况；图5为SlDnmt1RNAi后斜纹夜蛾中SlDnmt1mRNA表达水平检测，图中dsGFP表示GFPRNAi对照组，dsDNMT1表示SlDnmt1RNAi组。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1BmDnmt1被抑制表达的家蚕的表型1）家蚕Dnmt1dsRNA载体构建根据试剂盒T7RiboMAX™ExpressRNAiSystem（购自Promega公司）的说明书分别合成家蚕Dnmt1的dsRNA序列（SEQIDNO：1）、GFP的dsRNA序列（SEQIDNO：2），分别用于构建家蚕Dnmt1dsRNA载体及空白对照载体，用于后续的RNAi干扰实验。上述家蚕Dnmt1的dsRNA序列（SEQIDNO：1）：5’-AUCAAGCUGGAGUUGCAGAAUGCAAGUGGGCUAUUGAAAACGUGGAAGCUGCUUCUCAUGCUUAUUCAUUAAAUAAUAAAAGUUGUAUUGUAUUUAAUGAAGACUGUAAUGCACUUUUGAAAACUGUAAUGUCUGGUGCUAAGCACAGCGCGAAUGGACUGCGGCUCCCCAUGCAAGGAGAAGUGGAGCUUUUAUGUGGCGGGCCACCAUGUCAAGGCUUCUCCGGAAUGAAUCGUUUUAAUUCAAGAGAGUAUUCAAACUUCAAAAACUCAUUAGUUGCAUCGUAUUUAUCGUUUUGUGAUUAUUACAGACCUAAAUAUUUUAUACUGGAAAACGUUCGUAACUUUGUGGCCUUUAA-3’（SEQIDNO：1）。GFP的dsRNA序列(对照)（SEQIDNO：2）：5’-UACGGCGUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACC本文档来自技高网...

【技术保护点】
昆虫甲基转移酶Dnmt1作为害虫防治靶点的应用。

【技术特征摘要】
2016.10.24 CN 20161092614871.昆虫甲基转移酶Dnmt1作为害虫防治靶点的应用。2.昆虫甲基转移酶Dnmt1的抑制剂在制备杀虫剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述Dnmt1的抑制剂为抑制基因Dnmt1表达的物质。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抑制基因Dnmt1表达的物质为基因Dnmt1的RNAi序列。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述基因Dnmt1的RNAi序列选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑思春，徐关峰，张捷，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44