本发明专利技术提供了一种新的羰基还原酶及利用重组羰基还原酶进行不对称还原的方法。相对于其它酶催化的不对成酮还原反应，该酶具有宽泛的底物选择性，可以催化苯环、萘环、吡啶、苯并吡啶等多种取代芳香酮的还原，在催化浓度高达100g/L的底物时，产物的光学纯度仍高达99%以上,使用本发明专利技术方法制备所得的产物浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种羰基还原酶，含有编码该酶的核苷酸序 列的重组表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及该羰基 还原酶作为催化剂在不对称合成手性羟基化合物中的应用。
技术介绍
含有特定功能基团的光学活性手性醇是合成药物、农药及其它精细化学品的重 要手性砌块。而其中的手性芳香醇是合成手性药物、生物碱和其它手性化合物的重要中 间体，是一大类有着重要工业潜力的有机化合物，在当今制药领域里有着重要的作用。比 如，（S)-(+)-l，l-二苯基-2-丙醇及（R)-(-)-l，l-二苯基-2-丙醇可以通过氨化反 应制成有用的手性芳香胺化合物，进而合成手性农用化学品和手性医用药物；再比如， (S)-4-(l-羟基乙基）喹啉-2-羧酸是硫链丝霉肽（Thiostrepton)的重要中间体；再比如， (S) _1_(2, 6-二氯_3_氣代苯基）乙醇是合成克唑替尼的重要中间体；又如（S) _2_ (2-氯 代苯基）-2-羟基乙酸甲酯是合成用于治疗脑卒中、心肌梗死的畅销药氯吡格雷的重要中 间体。这样的用作药物中间体的手性芳香醇在制药领域中很多。 对于手性芳香醇的合成主要有两种途径：一是通过对潜手性芳香酮的对映选择性 还原，二是可以通过对外消旋体的拆分实现。 针对第一种途径，目前发展得比较成熟的有三种方法：第一是使用手性配体修饰 的金属氢化物试剂，在这些化合物中，将活泼氢的数目减至最小以获得高度的化学选择性， 引入的手性配体则为对映面选择性做出贡献，应用比较广泛的试剂是一种联萘酚修饰的氢 化铝试剂，简称BINAL-H ;第二种方法是在氢化反应中使用过渡金属络合物进行催化，常用 的过渡金属有钌和铑；第三种方法是使用硼杂噁唑烷催化体系，在使用硼烷还原羰基化合 物的过程中，引入手性的硼杂恶唑烷，使前两者在反应面的某一侧足够靠近发生反应，该体 系被命名为CBS体系。目前，对于潜手性芳香酮的不对称还原已经发展得比较成熟，但是上 述几种方法都需采用一些比较昂贵不易获得的试剂或配体，不适合大规模的制备手性醇。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对已报道的制备手性芳香醇的反应中收率低、 反应条件苛刻等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的羰基还原 酶，以及使用该羰基还原酶催化合成手性芳香醇的方法。还提供了编码该羰基还原酶的核 苷酸序列，含有该核苷酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该羰基还原酶的制备方 法，以及该羰基还原酶在催化羰基底物不对称还原中的用途。 本专利技术通过下述技术方案以解决上述技术问题： 本专利技术的第一方面提供了一种羰基还原酶，其是如下（a)或（b)的蛋白质： (a)由SEQ ID No: 1所示氨基酸序列组成的蛋白质。 SEQ ID No: 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质由来源于链霉菌Sreptacidiphilus albus的基因编码，具有羰基还原酶的功能，是一种新的羰基还原酶。 (b)在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的 具有羰基还原酶活性的蛋白质。 其中，所述的"几个"是指2个至100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。比 如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本专利技术人发现这样的融合蛋白同样具有羰基还原酶 活性。也就是说，只要由（a)衍生的蛋白质具有羰基还原酶活性，且衍生方式如上所述，都 可以达到本专利技术的专利技术目的。根据本专利技术，在如SEQ ID No: 1所示氨基酸序列的蛋白质（a) 分子中进行1~5个氨基酸残基的突变，仍然保持羰基还原酶活性。 SEQ ID No: 1所示的羰基还原酶和其他已知羰基还原酶之间的同一性为50%。本 专利技术的氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示的羰基还原酶与已知羰基还原酶的氨基酸序列的同 一*性低于90%，具有显著差异性。 在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBI Blastp程序进行比对，默认参数。 本专利技术的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本专利技术的羰基还原酶。优选 地，所述核酸是由SEQ ID No:2所示核苷酸序列组成的。 由SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成的核酸来源于链霉菌Sreptacidiphilus albus基因组，其可以从基因组DNA中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或 重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。 本专利技术中，SEQIDNo:2所示的基因命名为ABY-KRED-SA，全长828bp。其中，其编 码序列（⑶S)从第1个碱基起至第825个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该 序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N〇:l所示。 如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No: 1的氨基酸序列的 核苷酸序列不仅仅局限于SEQ ID N〇:2。本专利技术的羰基还原酶基因的核苷酸序列也可以是 编码序列表中SEQ ID No: 1所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，还可以通过适 当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本专利技术中多聚核苷酸的同系物 可以通过对核苷酸序列SEQ ID N〇:2的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺 失或添加来制得。 SEQ ID N〇:2的同系物也指启动子变体。在所述的核苷酸序列之前的启动子或信 号序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没 有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完 全替换，可提高目标蛋白的表达水平。 SEQ ID No:2的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID No:2所示序列的核酸 进行杂交的核苷酸序列。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的 方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个载 有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲 液的组成为〇· lwt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2~8XSSC ; 20 X SSC为3M氯化钠和0. 3M的柠檬酸组成的溶液；杂交温度为50~70°C ;在培养几个小 时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组 成为6X SSC+O. Iwt % SDS溶液，更优选为5X SSC+O. Iwt % SDS ;当用这种清洗缓冲液清洗 完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。 本专利技术的第三个方面提供了一种包含本专利技术的编码羰基还原酶的核苷酸序列的 重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本专利技术所述的编码羰基还原酶或其突变体的核 苷酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体， 如市售的质粒、粘粒、菌体或病毒载体等，优选质粒pET28a。较佳地，可通过下述方法制得 本专利技术的重组表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种羰基还原酶，其是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID No:1所示氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有羰基还原酶活性的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗煜，丁时澄，瞿旭东，田振华，
申请(专利权)人：南京博优康远生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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