本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术采用定点突变技术将黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶(GOD)基因(Genebank:FJ979866.1)进行定点突变，使其氨基酸序列突变位点为Y76C和Q279K；将突变基因克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA，转化Pichia pastoris X33，筛选得到表达量提高的葡萄糖氧化酶毕赤酵母菌株P.pastoris X33-pPICZαA-GODmut；酶学性质测定表明，突变的葡萄糖氧化酶基因能在毕赤酵母中稳定、高效的表达及遗传，突变菌株所表达的葡萄糖氧化酶的酶活性以及稳定性显著高于出发菌株。这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及基因工程领域，具体设及表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基 因和应用。
技术介绍
葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, GOD)在有氧条件下能专一'性地催化P-D-葡 糖生成葡萄糖酸和过氧化氨。GOD是同型二聚体分子，含有2个黄素腺嚷岭二核巧酸（FAD) 结合位点。每个单体含有2个完全不同的区域：一个与部分FAD非共价但紧密结合，主要 为声折叠；另一个与底物P -D-葡萄糖结合，由4个a -螺旋支撑1个反平行的P -折叠。 GOD广泛分布于动植物和微生物体内。由于微生物生长繁殖快、来源广，是生产GOD的主要 来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。 GOD已被广泛应用于食品、饲料、医药等领域，目前国外生产的GOD厂家主要是德 国的Boe虹inger和日本的T0Y0B0。产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制。 本专利技术采用定点突变技术将黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452 (CICC 2377) 的葡萄糖氧化酶（GOD)基因（Genebank:FJ979866. 1)进行定点突变，使其氨基酸序列突变 位点为Y76C和Q279K ;将突变基因克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZ a A，转化Pichia pastoris X33,筛选得到表达量提高的葡萄糖氧化酶毕赤酵母菌株。
技术实现思路
阳0化]本专利技术的目的之一是提供一种表达量提高的突变葡萄糖氧化酶G0D，其氨基酸序 列如沈Q ID NO. 1所示。沈Q ID NO. 1 : 本专利技术的再一目的是提供编码上述突变葡萄糖氧化酶GOD的基因，其核巧酸序列 如沈Q ID NO. 2所示。沈Q ID NO. 2: 所述突变基因是W Genebank:FJ979866. 1所示的序列为出发基因序列，通过定点 突变，获得葡萄糖氧化酶氨基酸序列在第76位发生酪氨酸突变为半脫氨酸、第279位发生 谷氨酷胺突变为赖氨酸的突变序列。 本专利技术的再一目的是提供一种构建产所述突变葡萄糖氧化酶的基因工程菌的方 法：用Stratagene的方法做定点突变技术，即用一对带有突变位点的引物扩增整个质粒， 具体包括如下步骤： (1)采用融合PCR方法将GOD基因序列中的EcoRI酶切位点突变，使其不能被 EcoRI酶消化。 似将上述本专利技术的编码上述突变葡萄糖氧化酶GOD的基因连接到pPICZ a A质 粒，构建重组质粒GOD-pPICZ曰A。 (3)用Stratagene的方法做定点突变技术，扩增含突变Y76C的GOD重组质粒。 (4)在做的基础上，用Stratagene的方法做定点突变技术，扩增含突变Q279K的 GOD重组质粒。 (5)将获得的重组表达载体转化Pichia pastoris X33得到基因工程菌； (6)将获得的重组基因工程菌进行发酵，诱导葡萄糖氧化酶的表达； (7)发酵结束后，回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶。 本专利技术的另一目的是提供一种应用上述基因工程菌株发酵生产葡萄糖氧化酶的 方法，是W构建得到的产葡萄糖氧化酶基因工程菌株为生产菌株，基因工程菌经种子培养 活化后接种到基本发酵培养集中，于30°C、200rpm条件下培养；当ODe。。值为1. 2-1. 5时，将 菌株转入诱导培养基中诱导蛋白的产生。 本专利技术采用定点突变技术将黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452 (CICC 2377) 的葡萄糖氧化酶（GOD)基因（Genebank:FJ979866. 1)进行定点突变，使其氨基酸序列 突变位点为Y76C和Q279K ;将突变基因克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZa A，转化 Pichia pastoris X33,筛选得到表达量提高的葡萄糖氧化酶毕赤酵母菌株P. pastoris X33-pPICZa A-GODmut ;酶学性质测定表明，突变的葡萄糖氧化酶基因能在毕赤酵母中稳 定、高效的表达及遗传，突变菌株所表达的葡萄糖氧化酶的酶活性W及稳定性显著高于出 发菌株。运为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。【附图说明】 W22] 图1重叠PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，M :DNA ladder 10, 000 ;1 :G0D2的PCR产 物；2 :G0D1的PCR产物； 阳02引 图2重组质粒pPIC Z a A-G0DTB的菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，1 :重组表达 质粒pPICZ a A-G0DTB转化子菌落PCR产物；空白：阴性对照；M :DNA ladder 10, 000 ; 图3重组质粒pPIC-GODTB用EcoRI和Notl酶切后的产物琼脂糖凝胶电泳图， 1:0臟1曰(1(16' 10,000;1-4:齡《/6(3〇1?1双酶切重组质粒口？1〔2〇4-60018,5:重组质粒 pPIC Za A-G孤T 阳0巧]图4. 1重组质粒pPICZ a A - GODmut琼脂糖凝胶电泳图，M :DNA ladder 10, 000 ; 1:重组质粒pPICZ a A - G孤mut ; 阳0%] 图4. 2重组质粒pPICZ a A -GODmut用EcoRI和Notl酶切后的产物琼脂糖凝胶电 泳图M :DNA ladder 10, 000 ;1:重组质粒pPICZ a A - GODmut的双酶切产物； 图4. 3 pPICZ a A-GODmut-TOPlO菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，1:阴性对照； 2 - 4 :pPICZ a A - G孤mut - T0P10 菌液 PCR ;M :DNA ladder 10, 000 ; 图 5 突变型重组菌 P. pastoris X33-pPICZ a A-GODmut 产 GOD 生长曲线； 图 6 出发菌株 P. pastoris X33-pPICZ a A-GOD 产 GOD 生长曲线； 图7葡萄糖氧化酶蛋白电泳SDS-PAGE，1 :发酵上清液；2 :经过纯化的葡萄糖氧化 酶溶液；M protein ladder。【具体实施方式】 W下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第=版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行； 所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本领域技术人员应该理解的 是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可W对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替 换，但运些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。 实验材料和试剂 1、菌株与载体 大肠杆菌菌株ToplO、毕赤酵母X33、载体pPICZ a A、Zeocin购自Invitrogen公 司。 2、酶与试剂盒 PCR酶、质粒提取试剂盒、胶纯化试剂盒购于上海生工公司，限制性内切酶购于 肥B公司。 3、培养基 大肠杆菌培养基为LB(1%蛋白腺，0. 5%酵母提取物，1%化化，pH7. 0)。LB-Amp 为LB培养基加lOOjig/ml氨节青霉素。LB-Zeocin为LB培养基加25]ig/ml Zeocin。 酵母培养基为YPD(1 %酵母提取物，2 %蛋白腺，2 %葡萄糖）。酵母筛选培养基为 YPDZ (YPD+100 y g/ml Zeocin)。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达量提高的突变葡萄糖氧化酶GOD，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：聂金梅，李阳源，周银华，陈丽芝，刘金山，李天碧，
申请(专利权)人：广东溢多利生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。