黑曲霉突变株ANPEP15M1及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程菌领域，具体涉及黑曲霉突变株ANPEP15M1及其应用。所述突变菌株ANPEP15M1的保藏号为GDMCCNO：63131。本发明专利技术的黑曲霉突变株能显著提高酸性蛋白酶的产量，发酵过程中生物量显著增加，利用发酵培养基对重组工程菌进行7L发酵罐发酵培养99h后，其中重组菌株的酸性蛋白酶总酶活达到26255U/mL，发酵效率明显优于同等条件下的现有生产菌株，适用于酸性蛋白酶的工业生产，且有效提高的生产效率，市场前景广阔。市场前景广阔。市场前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
黑曲霉突变株ANPEP15M1及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程菌领域，具体涉及黑曲霉突变株ANPEP15M1及其应用。

技术介绍

[0002]酸性蛋白酶是指蛋白酶具有较低的最适pH，并水解蛋白质的水解酶类。目前商品酸性蛋白酶的生产菌，主要是黑曲霉、黑曲霉大孢子变种、斋藤曲霉、根霉、杜邦青霉、血红色陀螺孔菌和微小毛霉等菌株。
[0003]曲霉酸性蛋白酶(EC 3.4.23.18，EC 3.4.23.19)是一类适合在酸性环境中(pH2.0
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5.0)分解蛋白质的酶类，包括曲霉蛋白酶I(Aspergillopepsin I)和曲霉蛋白酶II(Aspergillopepsin II)两大类。由于曲霉酸性蛋白酶能够提高单胃动物特别是幼龄动物对饲料蛋白成分的消化吸收率，促进其生长发育。酸性蛋白酶分解蛋白质的条件与动物体内消化系统的环境相似，故可通过提高动物对蛋白质的水解效率来提高对蛋白质的消化吸收率，以取得良好的喂养效果。同时，随着生物技术推广与合成生物学的研究深入，酸性蛋白酶通过工业发酵的方法获得已成现实，因此，酸性蛋白酶适合作为饲料添加剂的天然酶制剂。从另一方面看，酸性蛋白酶作为饲料添加剂加入到动物日粮中，可显著提高饲料转化率，从而减少饲料的浪费以及降低对环境的污染(氮的排放)，缓解我国蛋白质饲料资源缺乏的状况。
[0004]目前酸性蛋白酶生产菌株的产酶量仍不是很高，导致该酶的生产成本居高不下，也在一定程度上限制了酸性蛋白酶的广泛应用。挖掘产量更高，酶活更高的生产菌株或生产方法是急需的，此外，也有助于酸性蛋白酶更广泛地应用于酿造工业、制革工业、临床医学及食品工业等领域。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株。
[0006]本专利技术的另一目的是提供上述黑曲霉突变菌株的应用。
[0007]本专利技术的再一目的是提供包括上述黑曲霉突变菌株，或由上述黑曲霉突变菌株生产的酸性蛋白酶的制剂。
[0008]本专利技术的再一目的是提供制备酸性蛋白酶的方法。
[0009]根据本申请的黑曲霉菌株是重组表达酸性蛋白酶的菌株通过紫外诱变的方法筛选出的突变株，能显著提高酸性蛋白酶的产量，为低成本、规模化生产酸性蛋白酶奠定了基础。
[0010]根据本专利技术的高产酸性蛋白酶的黑曲霉(Aspergillus niger)突变菌株ANPEP15M1，于2023年1月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，(地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070)，保藏号为GDMCC NO：63131。
[0011]本专利技术提供了包含上述高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株的微生物制剂。
[0012]本专利技术提供上述高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株在酸性蛋白酶生产中的应用。
[0013]根据本专利技术的制备酸性蛋白酶的方法，所述方法包括发酵所述高产酸性蛋白酶的黑曲霉(Aspergillus niger)突变菌株ANPEP15M1的步骤。
[0014]根据本专利技术的制备酸性蛋白酶的方法，在30℃发酵，发酵过程中pH降至5.0时开始通氨通过流加氨水控制pH为4.8～5.2，通风量8L/min，转速：500～1000rpm，补料DE值控制在10；36小时至放罐补料DE值控制在20，然后逐渐加大转速，培养99h。
[0015]本专利技术的有益效果是：
[0016]本专利技术的黑曲霉突变株能显著提高酸性蛋白酶的产量，发酵过程中生物量显著增加，利用发酵培养基对重组工程菌进行7L发酵罐发酵培养99h后，其中重组菌株的酸性蛋白酶总酶活达到26255U/mL，发酵效率明显优于同等条件下的现有生产菌株，适用于酸性蛋白酶的工业生产，且有效提高的生产效率，市场前景广阔。
附图说明
[0017]图1显示了本专利技术的重组表达酸性蛋白酶载体pAN
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EXP
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ANPEP图谱；
[0018]图2显示了高产酸性蛋白酶黑曲霉ANPEP
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15M1菌种遗传稳定性验证图；
[0019]图3显示了高产酸性蛋白酶ANPEP15和ANPEP15M1黑曲霉菌株发酵酶活曲线图。
[0020]Aspergillus niger菌株ANPEP15M1，于2023年1月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，(地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070)保藏号为GDMCC No：63131。
具体实施方式
[0021]以下将结合实施例对本专利技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本专利技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本专利技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本专利技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本专利技术保护的范围。
[0022]以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0023]本专利技术的载体构建的规程和方法，使用基因工程领域惯用的规程和方法。
[0024]定义：
[0025]“基因”指在产生多肽中涉及的DNA片段，包括在编码区之前和之后的区域，以及在单个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
[0026]在本说明书中，“表达载体”指含有与一个或多个合适的控制序列有效连接的DNA编码序列的DNA构建体，所述控制序列能够实现编码序列在宿主中的表达。此类控制序列包括实现转录的启动子，控制此类转录的任选的操纵基因序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒，或单纯的是潜在的基因组插入序列。一旦转化到合适的宿主中，载体就可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在一些情况下，可以自身整合到基因组中。质粒是最常使用的表达载体形式。然而，本专利技术意在包括发挥等同功能的其它形式的表达载体，所述表达载体是或者将是本领域已知的。
[0027]“启动子”指涉及结合RNA聚合酶以起始基因转录中的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。可用于本专利技术的诱导型启动子的非限制性实例是糖化酶启动子，该启动子是诱导型启动子。
[0028]术语“宿主细胞”指细胞或细胞系，用于多肽生产的重组表达载体可以转染到所述细胞或细胞系中以表达多肽。真菌细胞能以本身已知的方式的通过涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及细胞壁的再生的过程进行转化。重组表达载体可以是任何载体，如质粒或病毒，其可以方便地进行重组DNA程序并导致核苷酸序列的表达。载体选择通常取决于载体与所述载体待引入的生产宿主的相容性。所述载体可以是线性或闭环质粒。所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.高产酸性蛋白酶的黑曲霉(Aspergillusniger)突变菌株ANPEP15M1，其特征在于，所述突变菌株ANPEP15M1的保藏号为GDMCCNO：63131。2.权利要求1所述的高产酸性蛋白酶的黑曲霉(Aspergillusniger)突变菌株ANPEP15M1的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述黑曲霉(Aspergillusniger)突变菌株ANPEP15M1用于制备酸性蛋白酶。4.一种制备酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括发酵权利要求1所述高产酸性蛋白酶的黑曲霉(Aspergillusniger)...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳源，黄江，何小梅，陈丽芝，贺金玲，黄佳乐，刘金山，周银华，冯国华，张智良，
申请(专利权)人：广东溢多利生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：