本发明专利技术提供了一株鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株及其应用，本发明专利技术所述鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株，保藏编号为CGMCC 10147。本发明专利技术用鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株研制的油乳剂灭活疫苗对鸭疫里默氏杆菌国内优势血清型1、2和10型代表菌株均具有100％的交叉保护力，可应用于鸭疫里默氏杆菌的广谱疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及一株鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株及 其作为广谱疫苗候选株应用于鸭疫里默氏杆菌油乳剂灭活疫苗。
技术介绍
鸭疫里默氏杆菌（Riemerellaanatipestifer,RA)病又称为鸭传染性衆膜炎，是 一种主要侵害鸭、火鸡和其他鸟类的禽类接触性传染病。1-8周龄雏鸭十分易感，主要病理 变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪样输卵管炎等，发病率高，病死率高， 耐过鸭多成僵鸭，生长迟缓，造成的经济损失重大，是当前危害养鸭业最为严重的传染病之 〇 鸭疫里默氏杆菌血清型复杂，目前世界范围内已确认的RA血清型有21个（1~21 型），国内报道的血清型至少有13个，分别为血清型1、2、3、5、6、7、8、10、11、13、14、15及未 定型，其中血清型1、2和10为国内引发感染的优势血清型，各血清型之间缺乏有效的交叉 保护 。 近年来，我国鸭疫里默氏杆菌感染发病呈上升趋势。该病的发展越来越复杂而且 呈动态变化，使用药物进行防治导致耐药性的普遍产生，既增加防治成本，也给食品安全和 人类健康带来了极大危害，因此疫苗免疫是一种高效而经济的手段。研宄表明，同一鸭场的 鸭群可以感染一种或同时感染几种血清型的鸭疫里默氏杆菌，而且感染鸭疫里默氏杆菌的 血清型还可能经常变化 ，因此理想的鸭疫里默氏杆菌疫苗应该可以同时提供针对几种血 清型的保护力。目前国外已有商品化针对血清1、2、5型鸭疫里默氏杆菌的灭活疫苗和弱毒疫苗 。针对血清1、2和10型鸭疫里默氏杆菌病的三价油乳剂灭活苗已有报道 ，具有较好 的推广价值，然而在制备疫苗时需要应用血清1、2和10型的三个菌株。因此，获得对优势 流行血清型菌株具有交叉保护作用的鸭疫里默氏杆菌菌株用作广谱疫苗候选株至关重要。 研宄表明，鸭疫里默氏杆菌伴侣蛋白GroEL和TonB依赖性受体TdRl蛋白（gi:312446409) 对鸭疫里默氏杆菌1、2、10型菌株具有部分交叉保护力或交叉反应性 ，迄今尚无具有有 效交叉保护力的鸭疫里默氏杆菌疫苗候选菌株报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1。 本专利技术的另一目的在于提供含鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1的广谱疫苗。 本专利技术的再一目的提供该广谱疫苗的制备方法。 为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 本专利技术的鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1中细菌脂多糖（LPS)是革兰氏阴性 菌表面的主要抗原成分，决定细菌的血清型。本专利技术利用LPS单抗筛选CH3转座子随机突 变库，获得一株鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1，该菌株缺失与LPS单抗结合的能力， 表明其LPS的抗原性发生了变化。进一步的研宄表明LPS抗原性发生变化的RA-M1菌株对 血清1、2和10型强毒攻毒具有100%交叉保护性。 本专利技术所述鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株，命名为鸭疫里默氏杆菌Riemerella anatipestifer，已于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏号为CGMCCNo. 10147。 本专利技术还提供一种含鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1的广谱疫苗。 本专利技术所述鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1在用于制备疫苗中的应用。 本专利技术所述含鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1的疫苗，包含菌量为 6. 7X109CFU/mL的鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株。 本专利技术所述的疫苗还包含MontanideISA70VG佐剂（赛比克MontanideISA 70VG)〇 其中，鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株与MontanideISA70VG佐剂的重量比为 3:7〇 本专利技术所述疫苗的剂型优选采用油乳剂。 本专利技术所述疫苗的制备方法，包括如下步骤： 1)先将RA-M1进行细菌培养，到生长期时加入0. 4%的福尔马林，37°C，200rpm振 荡培养18h灭活，根据细菌计数结果对灭活菌液进行配制，使其含菌量为6. 7X109CFU/mL; 2)然后取灭活RA-M1菌液以及MontanideISA70VG佐剂，按重量配比3:7充分混 匀搅拌10min，4°C保存。 本专利技术所述疫苗在制备预防鸭疫里默氏杆菌感染制品中的应用。 免疫印迹（Westernblotting)研宄表明，RA-M1LPS在与抗CH3兔血清的反应中， 其〇抗原成分较野生株CH3有明显的缺失现象，表明该突变株的抗原性发生了改变。 为了研宄该突变株是否具有对不同血清型RA的交叉保护力，将RA-M1按已报道的 方法制备油乳剂灭活疫苗，二次免疫后用血清1、2、10型RA强毒WJ4、Yb2和Hxb2进行 攻毒（100)5。)，结果表明，免疫鸭对町4、￥匕2和11处2攻毒获得了100%的交叉保护。因此， 鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株RA-M1可作为广谱疫苗候选菌株用于疫苗研宄。 本专利技术所述鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株，命名为鸭疫里默氏杆菌Riemerella anatipestifer，已于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏号为CGMCCNo. 10147。【附图说明】 图1为Southernblot(印迹法）鉴定转座子Tn4351对CH3全基因组插入位点的 个数。1、10yg经Xbal酶切后的pEP4351 (阳性对照）；2、10yg经Xbal酶切后的CH3基 因组（阴性对照）；3、10yg经Xbal酶切后的RA-M1基因组。结果显示RA-M1基因组只有 单个Tn4351插入位点。 图2a_2c为GenomeWalking(染色体步移技术）鉴定转座子插入位点。 图2a为第一轮PCR产物鉴定图，M:DL1，5000Marker(标记）；1_4分别为SP1分别 与AP1-AP4与突变株进行PCR的产物。 图2b为第二轮PCR产物鉴定图。M:DL1，5000Marker; 1-4分别为SP2分别与 AP1-AP4与突变株进行PCR的产物。 图2c为第三轮PCR产物鉴定图。M:DL1，5000Marker;1-4分别为SP3分别与 AP1-AP4与突变株进行PCR的产物。由图可知突变株第三轮PCR产物中AP2为单一的特异 性条带，故将此条带进行切胶回收，连T载体蓝白斑筛选后送上海华津生物科技有限公司 测序。图3-a PCR鉴定转座子插入M949_1603基因。M :DL 2, OOOMarker;1 :CH3 ;2: RA-M1 ;3 :阴性对照。突变株PCR扩增不到M949_1603基因。 图3-b定量PCR鉴定转座子插入致M949_1603基因失活。转座子插入导致突变株 RA-M1的M949_1603基因失活，因此检测不到其转录水平。M949_1603基因的缺失对其上下 游基因（M949当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株鸭疫里默氏杆菌脂多糖突变株，其保藏号为CGMCC 10147。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于圣青，邹洁驰，王小兰，丁铲，王少辉，韩先干，田明星，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。