一种检测c-kit基因突变的引物与方法技术

本发明专利技术提供一种检测c-kit基因突变的引物，包括针对外显子8的上游引物、下游引物，以及针对外显子17的上游引物、下游引物。本发明专利技术属于生物检测技术领域，本发明专利技术提供的引物可以实现c-kit基因外显子8和17突变的特异性检测，引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，尤其设及一种检测c-kit基因突变的引物与方 法。
技术介绍
原癌基因c-kit基因位于人类染色体4qll-12,编码145邸的跨膜蛋白CD117,属 于第III类酪氨酸激酶受体家族。c-kit基因的突变可能会造成不依赖配体的酪氨酸激酶持 续激活，从而引起下游信号通路的素乱，进而引发疾病。 急性髓系白血病（acutemyeloidleukemia,AML)W骨髓与外周血中原始和幼稚 髓性细胞异常增生为主要特征，目前尚无确切的病因，但可能与环境因素、电离福射、化学 接触W及与机体对某些病毒感染所致的特殊反应有关。据统计，急性髓系白血病患者中， 有约8%的患者发生了c-kit基因的突变，在核屯、结合因子相关性急性髓系白血病（core bindingfactor-AML，CBF-AML)患者中，c-kit基因外显子8和17突变的发生率较高，c-kit 基因外显子8和17主要突变形式是外显子8的插入缺失突变和外显子17的点突变。 中国专利申请200910201796. 6公开了检测c-kit基因突变的引物，该引物针对胃 肠道肿瘤中c-kit基因外显子9和11，通过外显子9和11突变位点的组合检测，指导肿瘤 患者对甲横酸伊马替尼类药物的治疗。 中国专利申请201410606037. 9公开了检测c-kit基因突变的引物和探针，该引物 和探针针对c-kit基因外显子9、11、13和17中的至少一种突变类型，采用巧光PCR进行扩 增，对产物纯化后进行测序分析，该引物和探针不能覆盖c-kit基因外显子9、11、13和17 的所有突变，而且该方法的实验操作复杂。 通过对c-kit基因外显子8和17突变的检测，有助于甲横酸伊马替尼应用的预 后，在帮助指导用药和个性化治疗方面具有重要意义。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种检测c-kit基因突变的新引物与 方法，该引物具有特异性好、灵敏度高等优点，实现了c-kit基因外显子8和17突变的准 确检测。本专利技术检测的位点包括c-kit基因外显子8 (c-kit-X8)和c-kit基因外显子17 (c-kit-X17)〇[000引本专利技术提供一种检测c-kit基因突变的引物，包括针对c-kit基因外显子8的上 游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTTCAGATTCTGCCCTTTGAACTTG(SEQIDNO. 1)和下游引物CAGGA AACAGCTATGACCTGAAATTCAAGTGAATTGCAGTCC(沈QIDNO. 2)，W及针对c-kit基因外显子 17 的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTGGTTTTCTTTTCTCCTCCAA(SEQIDNO. 3)和下游引物CAGG AAACAGCTATGACCTGCAGGACTGTCAAGCAGAG(SEQIDNO. 4)0[000引优选地，所述引物中，外显子8的上游引物、外显子8的下游引物、外显子17的上 游引物和外显子17的下游引物浓度比为1 :1 :1 :1。 相应地，本专利技术还提供一种检测c-kit基因突变的方法，包括如下步骤:A)提取 DNA样品；B)采用权利要求1或2中所述的引物进行PCR扩增；C)对扩增产物进行凝胶电 泳分析后，采用Sanger测序法检测，对检测结果进行分析。 优选地，所述步骤A)中的DNA样品为邸TA抗凝外周血或骨髓血的DNA样品。 优选地，所述步骤B)中的PCR扩增反应条件包括：阶段1 :98°CSmin;阶段2 :98°C 1〇3;阶段3:631：3〇3;阶段4:72°(：1111111;阶段5:返回到阶段2,30个循环；阶段6:721： Smin;阶段7 :25 °C保溫。 优选地，所述步骤C)中，采用Sequencher4. 1. 4软件对检测结果进行分析。 此外，本专利技术还提供检测c-kit基因突变的引物在制备检测c-kit基因突变试剂 中的用途。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种检测c-kit基因外显 子8和17突变的新引物，该引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本专利技术还提 供了一种检测c-kit基因突变的方法，通过使用特异性的引物，具有特异性好、灵敏度高、 准确性好等优点，可W为甲横酸伊马替尼的临床用药提供指导。【附图说明】 图1本专利技术提供的c-kit基因外显子8引物的扩增片段。 图2本专利技术提供的c-kit基因外显子17引物的扩增片段。[001引图3PCR扩增产物的凝胶电泳图。 图4c-kit基因外显子8野生型的部分测序图。 图5c-kit基因外显子8突变型的部分测序图。 图6c-kit基因外显子17野生型的部分测序图。[002引图7c-kit基因外显子17突变型的部分测序图。【具体实施方式】 下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。 实施例一引物 专利技术人针对c-kit基因外显子8和c-kit基因外显子17,设计了大量引物，通过引物反 应条件的优化和比较，筛选出了特异性好的引物。 表1本专利技术提供的引物实施例二引物的特异性 将本专利技术提供的引物于UCSC中进行Blasting，c-kit基因外显子8扩增片段位 于C虹4:55589610-55589931间，长度为322bp;c-kit基因外显子17扩增片段位于 C虹4:55599207-55599391间，长度为18化P。无其它同源基因，结果如图1至图2所示，与 c-kit基因参考序列相符。[002引使用表1中的引物、表2中的PCR扩增体系和表3的PCR扩增条件对检测样品进 行扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图3所示。结果显示，扩增产物的特异性高， 无非特异性扩增条带产生。 实施例Sc-kit基因突变的检测 提取邸TA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANampBloodDNAKit(购自Tiagen,货号：DP318)的说明书，将DNA样品稀释至l(K)ng/iiL备用。[002引 PCR扩增采用Q5?热启动超保真2XMasterMix(购自肥B公司，货号：M049化）， PCR扩增体系如表2所示，PCR扩增条件如表3所示。外显子8的上游引物、外显子8的下 游引物、外显子17的上游引物和外显子17的下游引物浓度比为1 :1 :1 :1，外显子8的上游 引物浓度、外显子8的下游引物浓度、外显子17的上游引物浓度和外显子17的下游引物浓 度都为lOp/mol。对当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测c‑kit基因突变的引物，其特征在于：包括针对c‑kit基因外显子8的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTTCAGATTCTGCCCTTTGAACTTG和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCTGAAATTCAAGTGAATTGCAGTCC，以及针对c‑kit基因外显子17的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTGGTTTTCTTTTCTCCTCCAA和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCTGCAGGACTGTCAAGCAGAG。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：燕启江，赵薇薇，于世辉，梁耀铭，胡昌明，
申请(专利权)人：广州金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44