具有生产N‑乙酰葡糖胺能力的棒状杆菌属微生物及用其生产N‑乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法技术

本发明专利技术涉及生产N‑乙酰葡糖胺的棒状杆菌属微生物，该微生物保留了6‑磷酸乙酰转移酶活性，以及用该微生物生产N‑乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有生产N-乙酰葡糖胺能力的棒状杆菌属微生物及用其生产N-乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法
本专利技术涉及基因改造的生产N-乙酰葡糖胺的棒状杆菌(Corynebacterium)属微生物，以及用其生产N-乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法。
技术介绍
葡糖胺是葡萄糖的氨基衍生物，以及N-乙酰葡糖胺是葡糖胺的乙酰化衍生物。它们是许多天然多糖的重要成分，并且能形成细胞的结构材料，构成细胞壁。N-乙酰葡糖胺是蛋白合成的重要组分，参与组织再生，因此N-乙酰葡糖胺在预防和治疗多种疾病中具有治疗潜力，诸如胃炎、食物过敏、炎性肠病(IBD)、憩室炎、急性和慢性形式的类风湿性关节炎和骨关节炎，以及由于骨关节组织代谢异常导致的病理状况。葡糖胺也被用作预防和治疗人类骨关节疾病的功能性食物。葡糖胺通过酸水解几丁质(chitin)而获得，几丁质是由N-乙酰葡糖胺衍生的复杂碳水化合物。可选地，葡糖胺也可以通过酸水解壳聚糖而产生。原料几丁质是N-乙酰葡糖胺和葡糖胺的共聚物，并且是节肢动物和真菌中常见的天然物质。几丁质可以从节肢动物废料(龙虾、小虾、磷虾、蟹、明虾的外骨骼)获得，并且最近更多从廉价的来源如用于柠檬酸生产的真菌生物质中获得常见的工业实践是通过如下方法来纯化几丁质：用酸和碱的组合处理几丁质，以除去附带矿物质、蛋白质等的其它杂质，然后长时间通过使用浓盐酸在高温下以低收率在单个步骤中将几丁质解聚并脱乙酰基成葡糖胺。作为游离碱的葡糖胺很不稳定，易降解。因此，产生稳定的盐，如盐酸盐。节肢动物废料和真菌生物质中葡糖胺的含量低，因此产生大体积的废物。葡糖胺非常昂贵，因为生产过程本身具有相对低的收率，并且是能源和化学集约的(energyandchemicallyintensive)。此外，常见形式的葡糖胺源于贝类，已知在对贝类敏感的人中有过敏反应的可能性。而且，原材料(例如，几丁质的来源，如蟹壳)的可用性逐渐变得有限。因此，对以高得率生产用于商业销售和使用的葡糖胺和N-乙酰葡糖胺的具有成本效益的方法存在需求。PCT公开WO02/66667公开了从微生物质制备葡糖胺以除去过敏反应可能性的方法。该生产方法克服了与贝类过敏有关的问题，但遇到的主要问题是得率低。更具体地，由于该方法依赖于在其它产物如柠檬酸发酵过程中产生的生物质废物，不足以生产足够量的葡糖胺以满足对该产品日益增长的市场需求。同时，N-乙酰葡糖胺目前是通过用有机乙酰化试剂如乙酸酐乙酰化葡糖胺而生产的，但这种生产方法需要的成本高。同样，由于生产得率低，不易大规模生产N-乙酰葡糖胺。为克服这些问题，美国专利7,332,304公开了通过大肠杆菌(E.coli)发酵生产N-乙酰葡糖胺的方法。该方法提出用大肠杆菌发酵以获得高N-乙酰葡糖胺生产得率，这极大地解决了所遇到的问题，包括由于传统工艺复杂导致的低N-乙酰葡糖胺生产得率。另外，已知葡糖胺可以通过简单的酸处理使N-乙酰葡糖胺去乙酰化来生产(NovikovV.Y.etal.Russ.J.Appl.Chem.1997：1467-1470)，因此也有可能以高得率生产葡糖胺。然而，该方法不适用于生产保健食品，因为大肠杆菌的使用产生了潜在有毒的内毒素。另外，葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶——其对N-乙酰葡糖胺的生产很重要(参见图1：GNA1)——在大肠杆菌中不存在，因此要引入其它微生物，如酵母。有一个限制是关键酶的表达需要可诱导的表达系统(DengM.D.etal.MetEng.2005：201-214)。关键酶不受调控的表达引起细胞增殖的严重抑制。可诱导表达系统的劣势在于需要诱导材料，导致生产成本增加，并且应当确定诱导时间点，因此认为其不适于大规模发酵的工业化生产。在生产安全和工业化改进的可能性方面，上述方法具有使用大肠杆菌和可诱导表达系统的缺点。迄今为止，大肠杆菌发酵技术被开发来克服原材料的可用性有限和生产得率低的问题。然而，还没有适于生产N-乙酰葡糖胺和葡糖胺的对人和动物安全的菌株。另外，还没有利用组成性表达系统而非可诱导表达系统以利于工业化酶生产的生产菌株的报道。为解决上述问题，本专利技术人开发了用于大规模发酵N-乙酰葡糖胺和葡糖胺而不引起环境问题，能够实现生产稳定性和工业应用的棒状杆菌属微生物，以及用该微生物生产N-乙酰葡糖胺和葡糖胺的方法，从而完成本专利技术。专利技术概述本专利技术的目的是提供基因改造的生产N-乙酰葡糖胺的棒状杆菌属微生物，优选具有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性和降低或缺失的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的棒状杆菌属微生物。本专利技术的另一目的是提供用棒状杆菌属微生物生产N-乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法。专利技术效果根据本专利技术，可以开发具有生产N-乙酰葡糖胺能力的棒状杆菌属微生物，因此使用该微生物生产N-乙酰葡糖胺或葡糖胺，从而实现没有过敏反应风险的N-乙酰葡糖胺和葡糖胺的大规模生产。进一步，其是工业上可应用的，因为保健食品和治疗材料可以安全地被生产，并且关键酶可以被组成性地表达。附图说明图1图解了生产N-乙酰葡糖胺的菌株中N-乙酰葡糖胺的生物合成途径和基因改造，其中nagA被失活并且外源基因GNA1被扩增；图2图解了pDZ-nagA1ST载体的结构，其中具有终止密码子的nagA1被克隆到pDZ中；图3图解了pECCG117-PEFTU-GNA1载体的结构，其中组成性表达启动子PEFTU先被克隆到pECCG117载体中，然后GNA1被克隆到其中；图4图解了pVWEx2-GNA1载体的结构，其中GNA1被克隆到pVWEx2载体中。优选实施方式详述一方面，本专利技术涉及具有生产N-乙酰葡糖胺和葡糖胺能力的棒状杆菌属微生物，其中该微生物具有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性以及降低或缺失的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性。在本专利技术中，葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶指通过乙酰化葡糖胺-6-磷酸生产N-乙酰葡糖胺-6-磷酸的酶。该酶存在于酵母(Saccharomyces)属微生物中，但不存在于棒状杆菌属微生物中。如本文所用，术语“具有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性”或“具有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性的棒状杆菌属微生物”意为棒状杆菌属微生物中不存在的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶基因被导入棒状杆菌属微生物中以表达葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶，因此，该棒状杆菌属微生物能用该酶将N-葡糖胺-6-磷酸转化为N-乙酰葡糖胺-6-磷酸。通过导入该基因将葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性赋予棒状杆菌属微生物的方法可以通过本领域熟知的多种方法进行。在本专利技术的具体实施方式中，编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的核酸序列被导入载体中，并且该重组载体被用于转化棒状杆菌属微生物。葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶基因是具有在棒状杆菌属微生物中可操作的核酸序列的任意基因。在一个具体实施方式中，该基因是源自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的基因，优选SEQIDNO.11的核酸序列。具体地，编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的序列可以在保留其活性的情况下进行某种程度的改造。本领域技术人员容易理解，通过人工改造保留70％或更多同源性的核酸序列等同于源自本专利技术核酸序列的序列——只要其保留了本专利技术所期望的基因活性。优选地，将启动子可操作地连接到本专利技术的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶基因，以便诱导该基因的表达。更优选地，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2008.10.20 KR 10-2008-01026331.棒状杆菌(Corynebacterium)属微生物，其具有生产N-乙酰葡糖胺的能力，其中所述微生物具有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性和降低或缺失的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性，其中所述葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶组成性地被表达。2.权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中所述葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶由核酸序列SEQIDNO.11编码。3.权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中所述组成性表达由EFTU启动子...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪国基，郑珍守，申秀安，朴惠兰，赵宰贤，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：
国别省市：