具有动物型糖链加成功能的植物细胞制造技术

本发明专利技术提供一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞。这种植物细胞含有一个编码动物来源的酶的外源基因，这种酶可以将一个岩藻糖残基转移到糖蛋白中糖链还原末端的乙酰氨基葡糖残基上。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞。这种植物细胞含有一个编码动物来源的酶的导入基因，这种酶可以将一个岩藻糖残基转移到糖蛋白中糖链还原末端的乙酰氨基葡糖残基上。 优选的，这种来源于动物的酶是a 1，6-岩藻糖基转移酶。 —方面，本专利技术涉及一种从该植物细胞再生的植物。 另一方面，本专利技术涉及一种生产具有动物型糖链加成功能的植物细胞的方法。该方法包括在植物细胞中导入一种来源于动物的编码酶的基因的步骤，其中这种酶可以将一个岩藻糖残基转移到糖蛋白糖链中的还原末端的乙酰氨基葡糖残基上。 在另一方面，本专利技术涉及一种生产具动物型糖链的糖蛋白的方法。该方法包括以下步骤通过在植物细胞中导入一种编码来源于动物的酶的基因，以及一种编码外源性糖蛋白的基因来转化植物细胞，其中的酶可将一个岩藻糖残基转移到糖蛋白的还原末端的乙酰氨基葡糖残基上，并且培养获得的转化的植物细胞。 本专利技术也涉及用上述方法所生产的一种糖蛋白。这种糖蛋白具有一个动物型糖链。附图说明 图1显示用于生产本专利技术中植物细胞的载体pBI221-FT的构建图。pBI221-FT载体特有的Sacl位点被更换为Sail位点。在该位点中插入一个a 1，6-FT基因。 图2显示用于生产本专利技术中植物细胞的载体pGPTV-HPT-FT的构建图。 图3是一张电泳后显色的胶的照片，染色体DNA是从转化株BY2-FT 2_13制备并通过PCR进行扩增的。 图4A、 B是一张电泳后显色的胶的照片，染色体DNA是从转化株BY2-FT 2， 3， 4和6制备的RNA中通过RT-PCR扩增所获得的。 图5是显示高效液相色谱(HPLC)分析一个结果的图。 图6是显示高效液相色谱(HPLC)分析一个结果的图。 图7是显示高效液相色谱(HPLC)分析一个结果的图。 图8是电泳胶印迹PVDF膜显色后的照片，显示本专利技术中应用植物凝血素的植物细胞产生的糖蛋白的分析结果。 图9是显示一种植物和一种动物的复合型糖链结构的示意图。在复合型糖链结构的核心部分，植物型糖链包含一个木糖残基，而动物型糖链也包含一个木糖残基。另外，一个岩藻糖残基以a 1，6方式与动物型糖链最内部的N-乙酰氨基葡糖残基连接，一个岩藻糖残基以a 1，3方式与植物型糖链最内部的N-乙酰氨基葡糖残基连接。 图IO是一个显示用于测量a 1，6-FT以及一种活性测量体系中底物糖链结构的示意图。 图11是转化体BY2-FT3培养细胞所产生的糖蛋白HPLC分析的色谱图。 图12显示从转化体BY2-FT3培养细胞所产生的糖蛋白的一种糖链结构(高甘露糖型糖链)的分析结果图。 图13显示从转化体BY2-FT3培养细胞所产生的糖蛋白的一种糖链结构(复合型糖链)的分析结果图。 图14显示从转化体BY2-FT3培养细胞所产生的糖蛋白的一种糖链结构(a 1，6-岩藻糖连接糖链)的分析结果图。 图15是一张电泳后显色的胶的照片，染色体DNA是通过PCR扩增从转化的植物FT(l) 、FT(2) 、FT1、FT2和FG3中制备的。 图16是电泳胶印迹PVDF膜显色后的照片，显示本专利技术中应用植物凝血素的植物细胞产生的糖蛋白的分析结果。具体实施例方式以下将详细描述本专利技术。 本行业中已知的分离和分析蛋白质的方法，以及免疫分析法，除特别提到的以外，可用于本专利技术中。这些技术可通过市场提供的试剂盒、抗体、标记物以及其它实施。本专利技术中所使用的技术将在以下的材料与方法部分中进行描述。 根据本专利技术的方法是针对一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞，这里所用的术语"动物型糖链"是指这样一种糖链，即其中岩藻糖残基与糖蛋白的核心糖链中的还原末端部分存在的N-乙酰氨基葡糖残基以al，6方式连接。优选的，岩藻糖残基是与存在于核心糖链的最核心部分的N-乙酰氨基葡糖残基连接的，而这种核心糖链是与蛋白质的天冬酰胺残基连接的。 植物细胞可以是任何植物细胞。植物细胞可以是培养的细胞、培养的组织、培养的器官或一种植物。优选的，植物细胞应是培养的细胞、培养的组织、或培养的器官，最优选的是培养的细胞。应用于本专利技术生产方法中的植物类型可以是可用于基因导入的任何类型的植物。可用于本专利技术中生产方法的植物类型的例子包括，茄科、poaeae、芸苔科、蔷薇科、豆科、瓜科(curcurbitaceae)、唇形科、百合科、藜科、伞形科家族的植物。 茄科家族植物的例子包括烟草属、茄属、曼陀罗属、番茄属、牵牛花属的植物。特别的例子包括烟草、茄子、土豆、西红柿、红辣椒和牵牛花。 POAEAE家族植物的例子包括稻属、大麦属、黑麦属、甘蔗属、稻田稗属和玉蜀黍属。特别的例子包括大麦、黑麦、稗、高粱和玉米。 芸苔科家族植物的例子包括萝卜属、芸苔属、ARABIDOPSIS、WASABIA和荠属。特别的例子包括日本白萝卜、油菜籽、拟南芥、日本辣根和荠菜。 蔷薇科家族植物的例子包括oru皿s、苹果属(malus)、梨属(py皿s)、草莓属和玫瑰属。特别的例子包括李子、桃、苹果、梨、荷兰草莓和玫瑰。 豆科家族植物的例子包括大豆属、豇豆属、菜豆属、碗豆、蚕豆属、花生属、红花草属、紫花苜蓿和苜蓿属。特别的例子包括大豆、小豆、菜豆、豌豆、蚕豆、花生、苜蓿和紫花苜蓿。8 瓜科家族植物的例子包括丝瓜，黄瓜属和香瓜属。特别的例子包括南瓜、倭瓜、黄瓜和甜瓜。 唇形科家族植物的例子包括薰衣草属、薄荷属和紫苏属。特别的例子包括熏衣草，薄荷和白苏植物。 百合科家族植物的例子包括葱属、百合属、郁金香属。特别的例子包括洋葱、大蒜、百合和郁金香。 藜科家族植物的例子包括菠菜属，特别的例子是菠菜。 伞形科家族植物的例子包括当归属、胡萝卜属、鸭儿芹属和芹属。特别的例子包括日本土当归、胡萝卜、北柴胡和芹菜。 优选的，本专利技术的生产方法中所使用的植物应该是烟草、西红柿、土豆、稻、玉米、萝卜、大豆、豌豆、紫花苜蓿或菠菜。更优选的，本专利技术的生产方法中所使用的植物应该是烟草、西红柿、土豆、玉米或大豆。"能将岩藻糖残基转移到还原末端的乙酰氨基葡糖残基的酶"是指植物细胞中糖蛋白的蛋白质部分合成以后，在糖链添加过程中可以将岩藻糖残基转移到还原末端的乙酰氨基葡糖残基的酶。这种酶的例子之一是al，6-岩藻糖基转移酶。这个酶可使岩藻糖以a 1，6的方式连接到糖蛋白离肽链最近处的N-端连接的糖链的N-乙酰氨基葡糖残基上，GDP-岩藻糖用作糖的供体。该酶可从任何动物细胞中获得，优选的是哺乳动物，更优选的是人。 优选的，这个酶定位于细胞的细胞器中。专利技术人相信，该酶存在于细胞的细胞器中(例如内质网和高尔基体)，并导致岩藻糖以a 1，6的方式连接到植物细胞外源蛋白质的还原末端部分所存在的N-乙酰氨基葡糖残基上。尽管专利技术人并不拘泥于一种特定的理论。"能将岩藻糖残基转移到还原末端的乙酰氨基葡糖残基的酶的基因"可以是利用编码该酶的核苷酸序列从任何动物细胞中分离到的基因，或是一种市售商品。这类酶可经修饰后适应于在植物中表达。对这种分离和修饰，有本行业熟练人员已知的方法。 例如对于哺乳动物，己从人和猪中克隆到a 1，6-岩藻糖基转移酶的cDNA(JBiochem(Tokyo) 1997三月；121 (3) :626-32 YanagidaniS， Uozx咖i N， Ihara Y， Miyosh本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞，其中的植物细胞中导入了编码动物来源的酶的基因，这种酶可以将一种岩藻糖残基转移到糖蛋白糖链还原末端的乙酰氨基葡糖残基上。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：藤山和仁，关达治，
申请(专利权)人：陶氏化学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]