N-乙酰葡糖胺转移酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种N-乙酰葡糖胺转移酶突变体及其应用，所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其编码基因如SEQ?ID?No.2所示。本发明专利技术通过易错PCR的方法对野生型N-乙酰葡糖胺转移酶（GNA1）进行改造，测得酶活力最高为25.3U/L，野生型GNA1酶活力为7.8U/L，突变体GNA1M的酶活力相较于野生型提高了3.24倍。

【技术实现步骤摘要】
N-乙酰葡糖胺转移酶突变体及其应用
本专利技术属于基因工程及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种N-乙酰葡糖胺转移酶突变体及其应用。
技术介绍
近年来发现氨基糖类通常作为复杂寡聚糖和多糖类中的单体残基。氨基葡萄糖是单糖葡萄糖的氨基衍生物。N-乙酰氨基葡萄糖是葡糖胺的乙酰衍生物。葡糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖和其他氨基糖类是许多天然多糖的重要组成部分。将氨基葡糖制成营养药品用于治疗动物和人的骨关节病等疾病。N-乙酰氨基葡萄糖也是治疗多种疾病的有价值的药物活性剂。由于N-乙酰氨基葡萄糖是动物体内蛋白合成的有价值和重要的成分，因此它对组织再生具有积极的影响，N-乙酰葡萄糖在预防和治疗各种疾病方面具有治疗潜能，诸如胃炎、食物过敏、炎症性肠病(IBD)、憩室炎、急性和慢性形式的类风湿性关节炎和骨关节炎，以及因骨关节组织代谢疾病导致的病理情况。由于工业生产的氨基葡萄糖不能适宜于所有的人，来源于有壳的水生动物的氨基葡萄糖，对海鲜过敏的人群是不适宜的，越来越多的消费者寻找不含有动物副产物的物质，N-乙酰氨基葡萄糖没有任何已经确定的副作用。通过发酵生产获得氨基葡萄糖的过程中，氨基葡萄糖的积累对微生物代谢是有害的，因此只有通过发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖，再对其进行水解即可获得氨基葡萄糖。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种N-乙酰葡糖胺转移酶突变体及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种N-乙酰葡糖胺转移酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。与野生型的N-乙酰葡糖胺转移酶相比，本专利技术的N-乙酰葡糖胺转移酶突变体发生改变的氨基酸序列为:F38S (第38位苯丙氨酸变为丝氨酸)，P64T (第64位脯氨酸变为苏氨酸)，I131N (第131位异亮氨酸变为天冬酰胺)。本专利技术还提供编码所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体的基因，其核苷酸序列为:i) Seq ID N0.2所示的核苷酸序列；或ii)Seq ID N0.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与Seq ID N0.2所示序列杂交的核苷酸序列；所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1 X SSPE或含0.1%SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下杂交，并用该溶液洗膜。本专利技术还提供含有编码所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体基因的载体、工程菌及转基因细胞系。优选地，所述工程菌的出发菌株为大肠杆菌。本专利技术还提供所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体在N-乙酰氨基葡萄糖合成中的应用。本专利技术进一步提供一种利用大肠杆菌发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，通过在大肠杆菌中过表达编码所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体的基因，从而提高N-乙酰氨基葡萄糖的发酵产量。所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体的筛选方法，包括以下步骤:(1)由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) S288C,扩增N-乙酸葡糖胺转移酶(GNAl)的编码基因gnal ；(2)采用易错PCR技术，以基因gnal为模板，扩增获得GNAl突变体基因；(3)将步骤(2)所得易错PCR产物及表达质粒pET28b用BamH I和Xho I双酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布至LB (Kan)平板，即得构建好的重组GNAl基因突变库；(4)将LB (Kan)平板上长出的菌落——对应转入LB (Kan)液体培养基中，置37°C摇床培养，待OD6tltl值达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，37°C继续培养12h，然后分别离心收集菌体，破碎，测定GNAl酶活力，挑选酶活力最强的一株，并测定其基因序列，结果SEQ ID N0.2所示。其中，所述野生型N-乙酰葡糖胺转移酶具有SEQ ID N0.3所示的基因序列和SEQID N0.4所示的氨基酸序列。本专利技术的另一方面提供所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体的制备方法，包括以下步骤:I) PCR扩增编码所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体的基因；2 )将步骤I)所得PCR产物连接表达载体pET_28b ；3)连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，获得表达产物；其中，步骤I)中PCR扩增所用引物为:正向引物:5'-GATCGGATCCATGAGCTTACCCGATGGATTTTATATAAGGC-3'反向引物:5'-GATCCTCGAGCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGCCTGC-3'其中，过表达的N-乙酰葡糖胺转移酶突变体C-端含有6个组氨酸标签。进一步采用亲和层析法分离纯化表达产物，分离纯化的步骤为:i)以NTA介质填柱，用2倍柱体积的去离子水洗涤，接着加NiSO4溶液至NTA介质结合度达到饱和，用5倍柱体积的NAT-O缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M NaCl)洗柱；ii)将含有表达的N-乙酰葡糖胺转移酶的大肠杆菌破碎菌体离心后得到的上清加入到Ni2+-NTA树脂柱中，用5倍柱体积的NAT-1缓冲液(即NAT-O缓冲液含有80mmol/L咪唑)洗涤介质以去除杂蛋白，最后用含有300mmol/L咪唑的NAT-O缓冲液洗脱带有6个组氨酸标签的N-乙酰葡糖胺转移酶，并进行SDS-PAGE分析。本专利技术的N-乙酰葡糖胺转移酶突变体(GNAlM)及其编码基因还可以通过人工合成序列的方法获得。本专利技术通过易错PCR的方法对野生型N-乙酰葡糖胺转移酶进行改造，测得酶活力最高为25.3U/L，野生型GNAl酶活力为7.8U/L，突变体GNAlM的酶活力相较于野生型提高T 3.24 倍。【附图说明】图1为PCR扩增野生型(GNAl)和突变体(GNAlM) N-乙酰葡糖胺转移酶基因的凝胶电泳检测结果；其中，I为野生型gnal，2为突变体gnal。图2为本专利技术实施例4中构建的表达载体的酶切检测结果；其中，M为DNA分子量标准 DL2000，I 为 pET-GNAl，2 为 pET-GNAlM。图3为野生型N-乙酰葡糖胺转移酶(GNAl)在大肠杆菌中表达与纯化的SDS-PAGE检测结果；其中，I为未诱导的菌体上清，2为经过诱导的菌体上清，3为经过纯化的GNAl蛋白。图4为N-乙酰葡糖胺转移酶突变体(GNAlM)在大肠杆菌中表达与纯化的SDS-PAGE检测结果；其中，I为未诱导的菌体上清，2为经过诱导的菌体上清，3为经过纯化的GNAlM蛋白。【具体实施方式】以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1N-乙酰葡糖胺转移酶基因的获得Hlyg 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) S288C 基因组 DNA 为 PCR 反应模板，按 SEQ ID N0.3 所示 序列设计正向引物 GNAl-F:5/ -GATCGGATCCATGAGCTTACCCGATGGATTTTATAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种N?乙酰葡糖胺转移酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种N-乙酰葡糖胺转移酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。4.含有权利要求2或3所述基因的载体。5.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，出发菌株为大肠杆菌。8.权利要求1所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体在N-乙酰氨基葡萄糖合成中的应用。9.一种利用大肠杆菌发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李荣杰，徐斌，汪本助，
申请(专利权)人：安徽丰原发酵技术工程研究有限公司，
类型：发明
国别省市：