本发明专利技术公开了一种提高真菌产10-去乙酰巴卡亭III产率的方法，其包括在培养基中培养产10-去乙酰巴卡廷III，当在25℃培养3天后，接着进行10℃培养6个小时，再进行12个小时25℃培养，然后再进行6个小时30度培养，如此12个温度变化循环，通过高低温的循环刺激来激发真菌10-去乙酰巴卡廷III质产量。本发明专利技术比之传统培养方法能显著提高10-去乙酰巴卡廷III，方法简单，生产成本低，只通过改变温度就能达到提高产率的目的，10-去乙酰巴卡廷III产率可提高2.4倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于真菌培育
，具体涉及一种提高真菌产10-去乙酰巴卡亭III 产率的方法。
技术介绍
紫杉醇是目前最好的抗癌化疗药物，尤其是对乳腺癌、子宫癌和卵巢癌等女性高 发癌症，然而由于其人工合成工艺复杂，价格奇高，因此，该药品主要提取自红豆杉，然而红 豆杉的紫杉醇含量极低，且该种植物生长极其缓慢，因此，通过巴卡廷III或10-去乙酰巴 卡廷III人工半合成获得紫杉醇是目前该药品的主要途径。尽管红豆杉中巴卡廷III或 10-去乙酰巴卡廷III含量较之紫杉醇高，但依然不能满足市场需求，因此导致紫杉醇价格 依然昂贵，不能充分满足市场需求。因此，如何快速生产巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷 III成为影响紫杉醇市场价格的主要因素。 近年来，提取自红豆杉的一些内生菌被发现能够产生巴卡廷III或10-去乙酰巴 卡廷III，这为通过发酵手段生产紫杉醇半合成原料提供了现实基础，但是，相比较红豆杉 中巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III的含量，内生菌发酵所产生的较低，因此，如何通过 适当的手段来提高其发酵产量成为这些内生菌能否应用到生产的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高真菌产10-去乙酰巴卡亭III产率的方法，解决了 现有技术中存在的原内生菌发酵后10-去乙酰巴卡廷III产量低的问题。 本专利技术所采用的技术方案是，一种提高真菌产10-去乙酰巴卡亭III产率的方法， 包括以下步骤：在培养基中培养木霉Trichodermasp.菌株IRB54,当菌丝体发酵培养3天 后，进行循环培养，对得到的培养液进行提取分离，得到10-去乙酰巴卡廷III。 本专利技术的特点还在于， 培养基为PDB培养基，其组成为：水1000ml、马铃薯600g、蔗糖280g、pH6. 5-7. 0。 在培养基中培养3天条件为：在25°C条件下培养摇床转速为230r/min-250r/min。 循环培养条件为：低温10°C培养6小时，25°C培养12小时，30°C培养6小时，循环 培养的循环次数12次，即12天。 10-去乙酰巴卡廷III提取分离的的步骤包括： 1)、培养液透过四层纱布过滤，过滤液置于70°c低压旋转蒸发器中进行蒸馏，当液 体剩余IOml时，置于体积比为3:2的氯仿/甲醇混合液，并充分混合，备用； 2)、过滤后菌丝体残渣被加石英砂充分研磨，然后将研磨残渣在50°C烘箱中充分 干燥，将干燥后的残渣置于体积比为3:2的氯仿/甲醇混合液充分混合，在40°C超声波30 分钟，备用； 3)、将1)中的氯仿/甲醇混合液在45°C的条件下进行真空旋转蒸馏除去氯仿和甲 醇，获得膏状提取物； 4)提取物被再次溶解在30ml的氯仿中，然后用30ml的水进行抽提，有机相氯仿在 40°C条件下通过旋转蒸发被蒸发，产生干燥提取物，即为10-去乙酰巴卡廷III粗提物； 5)该干燥提取物被溶解在5ml的甲醇中，并通过0. 451m的滤膜过滤，过滤后提取 物溶液备用于高效液相检测； 6)对菌丝体残渣提取物的氯仿/甲醇混合液，重复步骤1)-步骤5)提取的10-去 乙酰巴卡廷III。 本专利技术的有益效果是：本方法通过温度循环的物理方法来提高内生菌产10-去乙 酰巴卡廷III的产率，方法简单且不增加任何投资。本方法通过温度循环方法来提高内生 菌发酵产物，和一般化学方法相比能减少有含化学物对发酵产物的污染，减少提取纯化成 本。 本专利技术通过温度循环法来进行一株产10-去乙酰巴卡廷III的培养，使其10-去 乙酰巴卡廷III的产量显著提高，达到原来对照产量的2. 4倍。【附图说明】 图1是木霉Trichodermasp.菌株IRB54的菌落图和孢子及其孢子梗图。 其中，A)是菌落图；图B是菌落分生孢子及其分生孢子梗。【具体实施方式】 下面结合【具体实施方式】对本专利技术进行详细说明。 本专利技术提供一种提高真菌产10-去乙酰巴卡亭III产率的方法，包括以下步骤： 在培养基中培养木霉Trichodermasp.菌株IRB54,当菌丝体发酵培养3天后，进行 10°C 6小时，25°C 12小时，30°C 6小时循环培养，使菌株IRB54的生长受到高低温的刺激， 从而增加真菌次生物质的产量。 其中，培养基为PDB培养基，其组成为：水1000 ml、马铃薯600g、蔗糖280g、 pH6. 5-7. 0 ； 培养过程是：首先在25°C条件下培养3天，培养摇床转速为230r/min-250r/min。 温度循环培养的初始温度为低温l〇°C 6小时，再25°C 12小时，然后是30°C培养6小时。温 度循环的次数为12次，相当于12天。 所选择培养的产10-去乙酰巴卡廷III真菌为木霉木霉Trichodermasp.的 IRBS4 菌株（已公开，参考文献：Lietal. (2〇1δ) IsolationandIdentificationof al〇- DeacetylBaccatin-Ill-ProducingEndophytefromTaxuswallichiana.Appl. Biochem. Biotechnol. 175:2224-2231)，木霉Trichodermasp.菌株IRB54的菌落图和抱子及其抱子 梗图如图1所示。 10-去乙酰巴卡廷III提取分离的的步骤包括： 1)、培养液透过四层纱布过滤，过滤液置于70°C低压旋转蒸发器中进行蒸馏，当液 体剩余IOml左右时，置于氯仿/甲醇（3:2, v/v)混合液，并充分混合，备用。 2)、过滤后菌丝体残渣被加石英砂充分研磨，然后将研磨残渣在50°C烘箱中充分 干燥，将干燥后的残渣置于氯仿/甲醇（3:2, v/v)混合液充分混合，在40°C超声波30分钟， 备用。 3)将1)中的氯仿/甲醇混合液在45°C的条件下进行真空旋转蒸馏除去氯仿和甲 醇，获得膏状提取物。 4)提取物被再次溶解在30ml的氯仿中，然后用30ml的水进行抽提，有机相氯仿在 40°C条件下通过旋转蒸发被蒸发，产生干燥提取物（10-去乙酰巴卡廷III粗提物）。 5)该干燥提取物被溶解在5ml的甲醇中，并通过0. 451m的滤膜过滤，过滤后提取 物溶液备用于高效液相检测。 6)对菌丝体残渣提取物的氯仿/甲醇混合液，使用相同的方法提取的10-去乙酰 巴卡廷III。 7)将5)和6)中各自所获得的溶有提取物的5ml甲醇溶液混合为10ml，备用。 以99. 8%的10-去乙酰巴卡廷III作为标准品，用高效液相方法对上述提取自发 酵液和菌丝体的提取物进行10-去乙酰巴卡廷III含量的测定。 采用该方法与现有技术普通的培养方法（对照组）相比较，其产率如表1所示，采 用本方法的产率大大提高。 表1循环温度培养和对照10-去乙酰巴卡廷III的产率比较（单位：mg/l) 该专利技术通过温度循环法来提高木霉Trichoderma sp.菌株IRB54的10-去乙酰巴 卡廷III的产量，效果明显，操作简单。10-去乙酰巴卡廷III属于烷类化合物，是典型的次 生代谢产物，大量研宄结果表明，当微生物处于较高温或较低温度环境条下，其次生代谢产 物量会随之增加，本专利技术依据通过对产10-去乙酰巴卡廷ΠΙ的菌株IRB54的循环高低温 刺激来诱导10-去乙酰巴卡廷III产本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高真菌产10‑去乙酰巴卡亭III产率的方法，其特征在于，包括以下步骤：在培养基中培养木霉Trichoderma sp.菌株IRB54，当菌丝体发酵培养3天后，进行循环培养，对得到的培养液进行提取分离，得到10‑去乙酰巴卡廷III。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周修任，李勇超，代磊，杨靖，简在友，王鸿升，许桂芳，孟丽，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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