本发明专利技术涉及检测引物与试剂盒，具体公开了检测牛HCD携带者的特异性PCR引物及试剂盒。所述引物包括如SEQ ID NO.1～3所示的核苷酸序列，以待测样本总DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR扩增产物中仅出现171bp的电泳条带时，表示待测样本不携带HCD；当PCR扩增产物中同时出现171bp和366bp电泳条带时，表示待测样本携带HCD的杂合子；当PCR扩增产物中仅出现366bp电泳条带时，表示待测样本为HCD纯合子。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测引物与试剂盒，具体地说，涉及检测牛HCD携带者的特异性PCR引物及试剂盒。
技术介绍
在奶牛育种中，由于后裔测定、基因组选择等现代育种技术的应用，在极大地提高了选择准确性的同时，也潜在地提高了选择强度。由于人工授精(AI)等繁殖生物技术的应用，使个别优秀种公牛得到广泛使用，增加了群体的近交系数，降低了有效群体含量，隐性基因纯合的概率加大，使不良基因在奶牛群体中不断出现，随着基因组学研究的不断深入和高通量测序技术的迅猛发展，加快了奶牛隐性遗传缺陷的挖据、鉴定与应用。单倍型，在遗传学上是指在同一染色体上进行共同遗传的多个基因座上等位基因的组合。有害单倍型是新近几年在牛群中出现的隐性遗传缺陷的新形式，在荷斯坦牛群中已经发现20多种单倍型，成功进行区间定位的单倍型有15种。当这些单倍型隐性纯合时，就会表现出不同类型的临床症状、胚胎早期死亡等，是影响奶牛群繁殖健康的隐性杀手，严重影响着奶牛养殖者的经济效益。胆固醇缺乏单倍型(HCD，Haplotype associated with Cholesterol Deficiency)是在荷斯坦牛群中新发现的一种隐性遗传缺陷。其遗传方式是当一头犊牛从其父母处都遗传了HCD基因时，称为感染者(纯合子)。感染牛的血液中胆固醇含量极低，可阻止奶牛正常的体脂沉积，其临床表现为慢性腹泻、生长缓慢、体重降低，通常6月龄的犊牛易早期死亡。目前已知该遗传缺陷基因最早的来源是加拿大种公牛Maughlin Storm(HOCANM5457798)。HCD的分子遗传基础是在牛11号染色体(BTA11)上APOB(Apolipoprotein B)基因编码区有1299bp转录调控元件ERV2-1的插入突变，导致APOB基因转录终止、剪接异常，使原4567个氨基酸肽链被135个氨基酸残肽所取代，丢失了97％的蛋白质(Menzi等，2016)。2015年加拿大使用的荷斯坦种公牛约10％是已知或可能的HCD携带者。在LPI前100名的验证公牛中，有5头是HCD携带者；在基因组测定前100名的青年公牛中，有2头是携带者；Kipp等(2015)预测，德国每年大约有3400个HCD纯合子出生，携带率约8.7％。牛冷冻精液和人工授精技术的普及和广泛应用，导致优秀种公牛的影响和使用范围是世界性的。一头优秀种公牛一生可以生产几十万剂甚至上百万剂冷冻精液，其遗传影响可想而知。由于优秀种公牛冷冻精液在全世界范围内的流通和广泛使用，荷斯坦牛群中发现的有害单倍型带来的都是世界性的问题。这导致近年来奶牛育种工作者在重视优秀种公牛生产性能表现的同时，更加重视优秀种公牛是否携带一些不良隐性基因的影响。因此，建立一种有效的检测胆固醇缺乏单倍型的分子生物学方法，制定合理选种选配方案，是降低HCD纯合子的最好方法。目前，我国尚未开展相关的研究和检测工作，HCD单倍型在我国荷斯坦牛群中的携带情况尚不清楚。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种检测牛HCD携带者的特异性PCR引物、试剂盒及检测方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术经严格筛选后提供一种检测牛HCD携带者的特异性PCR引物，其特征在于，所述引物包括：上游引物F：5’-TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3’；下游引物R1：5’-AGATGATGCCCCTCTTGATG-3’；下游引物R2：5’-CACTCCTAATTGCCCAGGAA-3’。进一步地，本专利技术提供了前述引物在制备检测牛HCD携带者的试剂盒方面的应用，并提供了含有前述引物的试剂或试剂盒。所述试剂盒包括：本专利技术所述特异性PCR引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、10×Buffer、ddH2O。所述试剂盒的工作程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58±8℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。经过对PCR反应程序试剂盒的优化发现，当退火温度为62℃时，PCR扩增特异性最好，条带单一，且最亮。能够有效保证扩增的有效性和准确性。第二方面，本专利技术还提供了一种非疾病的诊断和治疗目的的检测牛HCD携带者的方法，该方法可用于牛HCD单倍型的筛选和鉴定工作。所述方法具体为：以待测样本总DNA为模板，利用本专利技术所述引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR扩增产物中仅出现171bp的电泳条带时，表示待测样本不携带HCD；当PCR扩增产物中出现366bp电泳条带时，表示待测样本携带HCD。且进一步地，当PCR扩增产物中同时出现171bp和366bp电泳条带时，表示待测样本为携带HCD的杂合子；当PCR扩增产物中仅出现366bp电泳条带时，表示待测样本为HCD纯合子。进一步地，本专利技术PCR反应体系总体积25μL：更进一步地，PCR工作程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58±8℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。优选退火温度为62℃。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了检测牛HCD携带者的特异性PCR引物及试剂盒，并提供了利用所述特异性PCR引物进行多重PCR法检测牛胆固醇缺乏单倍型的方法，具体为利用SEQ ID NO.1～3所示的核苷酸序列为引物，对牛的总DNA进行PCR扩增，得到SEQ ID NO.4和或SEQ ID NO.5所示的DNA序列，通过琼脂糖电泳检测，得到如附图1所示的基因型，从而可以直接判定HCD携带者的基因型。本专利技术还优化了上述PCR的反应程序，开发了一套检测HCD单倍型的的PCR检测方法，为荷斯坦牛的选种、选配提供了技术支撑。本专利技术建立了一种快速、准确、高效的胆固醇缺乏单倍型(HCD)分子检测方法，为奶牛HCD单倍型因的分子筛查提供一种技术手段，为在今后的育种工作中有计划地降低HCD单倍型频率提供了技术支撑，为奶牛场进行科学的选种选配提供了依据。附图说明图1为检测牛胆固醇缺乏单倍型(HCD)携带者的PCR电泳图；其中，泳道1、3、4：不携带HCD单倍型；泳道2：HCD单倍型携带者；泳道5：阳性对照；M：100bp DNA ladder Marker。图2为正常个体和HCD携带者的测序峰图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1 引物设计依据GenBank上牛APOB基因序列(ID：494004)，并参考Schütz等(2016)针对APOB基因设计的检测HCD单倍型的引物序列，利用在线引物设计软件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)进行检测HCD的特异性引物设计，获得引物对：上游引物APOB-Primer-F：5’-TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3’；下游引物APOB-Primer-R1：5’-AGATGATGCCCCTCTTGATG-3’，该引物对横跨APOB本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测牛HCD携带者的特异性PCR引物，其特征在于，所述引物包括：上游引物F：5’‑TGCAAAGCCACCTAGCCTAT‑3’；下游引物R1：5’‑AGATGATGCCCCTCTTGATG‑3’；下游引物R2：5’‑CACTCCTAATTGCCCAGGAA‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种检测牛HCD携带者的特异性PCR引物，其特征在于，所述引物包括：上游引物F：5’-TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3’；下游引物R1：5’-AGATGATGCCCCTCTTGATG-3’；下游引物R2：5’-CACTCCTAATTGCCCAGGAA-3’。2.权利要求1所述的引物在制备检测牛HCD携带者的试剂盒方面的应用。3.含有权利要求1所述的引物的试剂或试剂盒。4.一种检测牛HCD携带者的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：权利要求1所述的特异性PCR引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、10×Buffer、ddH2O及阳性对照。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min。6.根据权利要求5...
【专利技术属性】
技术研发人员：李艳华，麻柱，刘林，赵凤，吕小青，韩广文，朱玉林，孙东晓，
申请(专利权)人：北京奶牛中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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