一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法技术

本发明专利技术涉及一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，包括以下步骤：提供人类羊膜组织、用PBS缓冲液冲洗然后剪碎、加入质量浓度为0.1～0.3％的胰蛋白酶进行消化、加入I型胶原酶及高糖DMEM基本培养基至I型胶原酶终浓度为0.1～0.2％消化、离心分离，取沉淀物、沉淀物用PBS溶液重悬，过滤后离心分离，弃去上清液，获得人羊膜间充质干细胞。与现有技术相比，本发明专利技术利用少量胰蛋白酶预处理羊膜组织，使羊膜组织疏松，进而利用组织特异性更好的I型胶原酶处理羊膜，大大缩短了消化的时间，简化了原代分离的步骤，而且能够获得较高的干细胞产量，获得的干细胞活力也相比现有技术大大提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞
，具体涉及一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养 方法。
技术介绍
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是中胚层来源的具有高度自我更 新能力和多向分化潜能的多功能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增， 并能在特定条件下分化为神经细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。MSCs是多能 干细胞，具有横向分化或跨系分化的能力，不仅支持造血干细胞的生长，还可以在不 同诱导条件下，在体外分化为多种组织细胞。MSCs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治 疗和组织工程的首选种子细胞。 骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)是 较早被认识的一种间充质干细胞，但由于抽取骨髓会给患者带来极大的痛苦，而且随着年 龄的增长，细胞数量显著下降，分化能力逐渐降低，从而较难进行推广使用。目前已从脂肪、 脾脏、脐血、脐带、胎肝及胎肾等组织器官中分离出间充质干细胞，但均存在一定的局限性， 如取材困难、受年龄限制、涉及伦理问题、组织中间充质干细胞含量少等。所以寻求一种来 源丰富，干细胞含量高，取材方便，无创性并且不受伦理学限制的MSCs来源已然成为如今 的研宄热点。 最近有研宄发现，AMSCs具有与BMSCs相似的表型，且具有自我更新和多向分化潜 能，且增殖能力比BMSCs更强。AMSCs低表达HLA-ABC，而不表达HLA-DR，从而说明AMSCs具 有低免疫原性，用于同种异体、异种异体移植后，均不会发生免疫排斥反应，而且AMSCs无 致瘤性，这为各种疾病的细胞替代治疗提供了新的选择。 人羊膜来源于人胎盘组织，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性，厚0. 02? 0.5mm。在电镜下，其分为5层：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。羊膜属 于孕妇生产后的废弃物，一个胎盘的羊膜面积大约有600cm 2,而且羊膜易于从胎盘剥离，所 以因羊膜具有取材方便，原料充足的特点而被认为是目前间充质干细胞的最佳来源。目前， hAMSCs原代分离培养方法可分为组织块培养法和酶消化培养法两种，组织块培养法由于不 是每个组织块都能成功培养出细胞，且容易混入其他杂细胞，同时培养周期较长，不利于快 速大量获取细胞，难以满足干细胞研宄的需求。酶消化培养法是目前羊膜干细胞分离方法 的主流，不过鉴于羊膜组织结构致密，消化酶的类型选择会对干细胞分离后的活性有着至 关重要的影响。现有技术利用II型胶原酶分离的技术有着耗时长，细胞得量低以及活性下 降等弱点。
技术实现思路
专利技术的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种人羊膜间充质干细胞原代分 离及培养方法，该方法利用少量胰蛋白酶预处理羊膜组织，使羊膜组织疏松，进而利用组织 特异性更好的I型胶原酶处理羊膜，大大缩短了消化的时间，简化了原代分离的步骤，而且 能够获得较高的干细胞产量，获得的干细胞活力也相比现有技术大大提高。 为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： -种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于包括以下步骤： (1)提供人类羊膜组织； ⑵用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎； ⑶加入质量浓度为〇. 1?〇. 3%的胰蛋白酶进行消化； (4)消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎； (5)加入I型胶原酶及高糖DMEM基础培养基，至I型胶原酶终浓度为0. 1?0. 2% 消化至羊膜组织块融化； (6)用PBS缓冲液稀释消化后的组织液，离心分离，取沉淀物； (7)沉淀物用PBS溶液重悬，过滤后离心分离，弃去上清液，获得人羊膜间充质干 细胞； (8)使用无血清培养基重悬人羊膜间充质干细胞，调整细胞密度为（3? 10) X105/mL置于添加了 EGF的培养皿中，移入C02培养箱中培养48h后换液，去除杂质，每 隔2?3d换一次培养基。 优选地，步骤（2)将羊膜组织剪碎至6X6cm2分装于50mL离心管中，步骤（3)胰酶 添加量为45mL，并在恒温摇床中消化，消化时间为30min，消化温度为37°C，转速为150? 300r/min。 优选地，步骤（4)将羊膜组织剪碎至1mm2后转移至125mL储液瓶中，加入20mL质 量浓度为〇. 5 %的I型胶原酶及高糖DMEM基础培养基，至I型胶原酶终浓度为0. 1?0. 2 % 进行消化，消化在恒温摇床中进行，消化温度为37°C，转速为250?300r/min，消化至组织 块融化。 优选地，所述无血清培养基为UltraCULTURE MEDIUM培养基。 优选地，步骤（6)离心速度为1500?2000r/min，离心时间为5min。 优选地，步骤（7)经100 y m,离心速度为1500?2000r/min，离心时间为5min。 优选地，步骤⑶采用规格为10cm的培养皿，EGF添加量为100 y L，浓度为1 y g/ mL〇 优选地，待原代人羊膜间充质干细胞生长至80 %融合时，即用0.25%的 EDTA-Trypsin消化，进行传代培养。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果是： 本专利利用少量胰蛋白酶预处理羊膜组织，使羊膜组织疏松，进而利用组织特异 性更好的I型胶原酶处理羊膜，从而缩短了消化的时间，提高了产量与细胞活力。 1、本专利技术探索出最适合人羊膜组织特点的酶解种类、酶解的顺序、酶解的条件，通 过本专利技术的技术方案能够将人羊膜组织彻底酶解，将人羊膜间充质干细胞释放出来，获得 数量较多、纯度较高的干细胞，同时不会破坏干细胞的结构，不影响干细胞的活性，保证获 得的干细胞具有较高的活力，可以大量培养，满足研宄需求。 2、在本专利技术中，前期采用少量的胰蛋白酶进行消化，在规定的酶的用量及消化条 件下，可以使羊膜组织处于刚好疏松，此时羊膜表层的上皮细胞也刚好被去除，最适合利用 对人羊膜组织特异性更好的I型胶原酶去酶解消化，消化过程对细胞损伤小，细胞活率高， 消化后得到的干细胞量大且纯度高，在之后的传代培养过程中能够保持良好的细胞活性及 增殖能力。 3、本专利技术获得人羊膜间充质干细胞的周期短，产量及活性高，分离出来的羊膜间 充质干细胞接种后三天可生长融合至80% -90%，有利于快速大量获取干细胞，适合大规 模化生产应用 4、本专利技术使用无血清培养基（Ultra⑶LTURE MEDIUM)进行细胞培养，可以避免含 血清培养基重血清对细胞的具有潜在毒性作用和血清源性污染。 【附图说明】 图1为本专利技术的人羊膜间充质干细胞原代细胞的表面标准物的表达情况图； 图2为本专利技术的人羊膜间充质干细胞P2代细胞的增殖曲线图； 图3为本专利技术的人羊膜间充质干细胞P2代细胞成脂诱导后细胞形态变化图； 其中，A为阴性对照，未诱导的羊膜间充质干细胞形态图；B为成脂诱导后10天，无 油红0染色的细胞形态图；C为成脂诱导10天后，油红0染色的细胞形态图；D为成脂诱导 10天后，油红0染色的细胞形态图。 图4为本专利技术的人羊膜间充质干细胞P2代细胞成骨诱导后细胞形态本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于包括以下步骤：(1)提供人类羊膜组织；(2)用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎；(3)加入质量浓度为0.1～0.3％的胰蛋白酶进行消化；(4)消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎；(5)加入I型胶原酶及高糖DMEM基础培养基，至I型胶原酶终浓度为0.1～0.2％消化至羊膜组织块融化；(6)用PBS缓冲液稀释消化后的组织液，离心分离，取沉淀物；(7)沉淀物用PBS溶液重悬，过滤后离心分离，弃去上清液，获得人羊膜间充质干细胞；(8)使用无血清培养基重悬人羊膜间充质干细胞，调整细胞密度为(3～10)×105/mL置于添加了EGF的培养皿中，移入CO2培养箱中培养48h后换液，去除杂质，每隔2～3d换一次培养基。

【技术特征摘要】
1. 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 提供人类羊膜组织； (2) 用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎； (3) 加入质量浓度为0. 1?0. 3%的胰蛋白酶进行消化； (4) 消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎； (5) 加入I型胶原酶及高糖DMEM基础培养基，至I型胶原酶终浓度为0. 1?0. 2 %消 化至羊膜组织块融化； (6) 用PBS缓冲液稀释消化后的组织液，离心分离，取沉淀物； (7) 沉淀物用PBS溶液重悬，过滤后离心分离，弃去上清液，获得人羊膜间充质干细胞； (8) 使用无血清培养基重悬人羊膜间充质干细胞，调整细胞密度为（3?10) X105/mL 置于添加了 EGF的培养皿中，移入C02培养箱中培养48h后换液，去除杂质，每隔2?3d换 一次培养基。2. 如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征在于：步骤 (2)将羊膜组织剪碎至6X6cm2分装于50mL离心管中，步骤（3)胰酶添加量为45mL，并在 恒温摇床中消化，消化时间为30min，消化温度为37°C，转速为150?300r/min。3. 如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，葛啸虎，冯德龙，王小燕，马岩岩，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44