本发明专利技术提供一种使用多能干细胞制备褐色脂肪细胞的方法、其中间产物细胞凝聚物的制造方法、以及通过该方法制造的源自多能干细胞的细胞凝聚物和源自多能干细胞的褐色脂肪细胞以及使用源自多能干细胞的褐色脂肪细胞的细胞疗法。本发明专利技术是使用多能干细胞制造褐色脂肪细胞的方法，其特征在于，通过包括工序(A)的方法由多能干细胞形成细胞凝聚物，通过包括工序(B)的方法由细胞凝聚物得到褐色脂肪细胞；(A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序；(B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】源自多能干细胞的褐色脂肪细胞、源自多能干细胞的细胞凝聚物，其制造方法以及细胞疗法、内科疗法
本专利技术涉及使用多能干细胞制造褐色脂肪细胞的方法、其中间产物细胞凝聚物的制造方法、以及由该方法制造的源自多能干细胞的细胞凝聚物和源自多能干细胞的褐色脂肪细胞以及使用源自多能干细胞的褐色脂肪细胞的细胞疗法、内科疗法。
技术介绍
近年来，肥胖者的数量在世界范围内不断增加。“肥胖”可以说是所有生活习惯病的根源，与肥胖相关的诸多疾病(糖尿病、高脂血症、由高血压引起的动脉硬化症以及由其引起的缺血性心脏病、脑溢血等)在包括日本在内的发达国家的死因中占上位。尤其是对于日本人，虽然与欧美人相比肥胖程度较低，但糖尿病容易发病，所以应对肥胖越发变得紧急。另外，在中国、巴西、印度、俄罗斯等新兴国家中，肥胖者的增加率更为显著，已成为较大的社会问题。肥胖治疗的基本自不必说是基于食物疗法和运动疗法的生活习惯的改善，然而肥胖者变瘦并不容易。不能遵守食物疗法的肥胖症患者并不稀少。而且因伴随肥胖的诸多疾病(变形性关节病、糖尿病性坏疽、心功能不全等)而无法实施运动疗法的困难病例也不少。另一方面，如同俗话所说的“越吃越瘦”，很早之前已指出作为肥胖的原因除了摄食过度、运动不足以外还存在“重要因素”。以往的肥胖研究中，白色脂肪组织(WAT)是主要的研究对象。然而，最近在解析核医学检查(PET/CT)的数据之际偶然发现一直认为只有啮齿类才会有的褐色脂肪组织(BAT)在人体中也存在(非专利文献I)。同样的报道相继被公开，也报道了 BAT量与肥胖代谢综合征的发病呈逆相关。并且，现在已经认识到在考虑肥胖的病态方面，BAT是极其重要的组织。BAT与WAT在产生上也极其不同。BAT在胎儿期已经形成，而WAT主要是在出生后发展。并且，已知包括人在内的大型哺乳类中，在出生后2天以内大半BAT会消失(生理性消失)，而该机理尚不明确。而且，残余的BAT也随着年龄的增加渐渐消减，其机理也尚不明确。如此，为了正确理解BAT，解明出生后出现的生理性消失、伴随年龄的增加而消失的机理变得重要。尤其是对于解明生理性消失的机理而言，应明确的是小鼠等小型哺乳类没有用处。WAT是蓄积脂肪的能量储藏组织，相对于此，BAT是使脂肪积极燃烧的能量产生组织。两者在细胞形态和基因表达上也呈现完全不同的特性。形态学上，白色脂肪细胞含有单房性大脂肪滴，缺乏线粒体(仅少量的线粒体存在于核周围)，其形态反映氧化磷酸化的低活性状态，分裂化。另一方面，褐色脂肪细胞含有多房性小脂肪滴、线粒体丰富(在脂肪滴周围局部存在)，其形态反映氧化磷酸化的高活性化状态，以纵长绳状融合，内部具有多个发达的梯子状嵴。关于基因表达，作为对WAT特征性的物质可举出抵抗素(resistin)、磷酸丝氨酸转氨酶 _1 (phosphoserine aminotransferasel, PSAT1)等。作为对 BAT 特征性的物质可举出解偶联蛋白-1 (uncoupling proteinl, UCP1)、PR结构域蛋白16 (PR domaincontainingl6, PRDM16),除此之外还可以举出极长链脂肪酸样延长因子-3 (elongationof very long chain fatty acids_like3, EL0VL3)、细胞死亡诱导 DFFA 样效应因子A (cell death-1nducing DFFA-1ike effector A, CIDE-A)、过氧化物酶体增殖物激活受体- a (peroxisome proliferator-activated receptor a , PPARa )、共激活因子I a (coactivatorl a , PGCl a )、细胞色素 C (cytochrome C, Cyt_c)、上皮“V” 型抗原(epithelial V-1ike antigen, EVA1)、酪氨酸激酶 3 型受体(neurotrophic tyrosinekinase receptor type3, NTRK3)等。其中，UCPl具有使线粒体中的氧化磷酸化与ATP产生解耦联的作用，所以具有能够阻止不可避免地伴随氧化磷酸化产生活性氧的效果。即，BAT通过UCPl的表达，发挥消除伴随生命活动的氧化应激这样的应特别指出的效果。另外，已知WAT和BAT在生物体中具有相反的生理效果。WAT在脂肪蓄积过度而细胞肥大化时诱发氧化应激。其结果，在脂肪组织中引起炎症，因炎症性细胞因子等的影响而在个体水平上诱发胰岛素抵抗性。另一方面，BAT因高度表达UCP1，所以不会诱发氧化应激，个体水平上的胰岛素敏感性高。如此地，BAT不仅具有抗肥胖作用，还具有胰岛素抵抗性的改善作用，所以期待对II型糖尿病的预防效果和治疗效果。并且，最近报道了 BAT从血中积极地摄取脂质，将其燃烧而积极地消耗，具有高脂血症的治疗效果(非专利文献2)。并且，冠状动脉搭桥手术`中，通过将患者本人的WAT移植到手术部分，从而至少短期提高成效，但需要进行冠状动脉搭桥手术的患者大多已经并发有代谢综合征，所以因移植的脂肪细胞中的炎症反应为诱因、氧化应激的诱发而从长期来看有可能发生手术后的血管再狭窄。实际上，冠状动脉狭窄病例中也已知冠状动脉周围WAT较多。所以，若能将不引起氧化应激的BAT移植到冠状动脉搭桥手术部分，则可期待长期成效的提闻。如此地，可期待对肥胖、胰岛素抵抗性、II型糖尿病、高脂血症的治疗效果以及冠状动脉搭桥手术的成效提高效果的BAT，对于代谢综合征相关诸多疾病的根治而言，是重要且贵重的组织。然而，关于人体中的BAT的产生、增殖机制、功能控制等尚有很多不明点。而且，作为源自脂肪组织的荷尔蒙与代谢调节相关而被周知的脂肪因子均是由WAT鉴定的，可期待发挥比现有脂肪因子还优异的抗肥胖和代谢改善作用的“BAT特异性脂肪因子”还未被鉴定出来。作为这样的有关BAT的重要发现仍欠缺的理由是因如下的原因基本无法从正常人志愿者得到BAT标本。即，可举出I)鉴定BAT的部位需要大暴露量的PET/CT检查；2)并非所有的受试者通过PET/CT检查就能使BAT可见化；3)人成体内BAT在多个部位(后颈部、各胸椎的肋等)分散存在，其量并不多(总重量在300g以下);4)关于去除如此微小组织的BAT时产生的不利点(代谢综合征发病风险增大等)没有充分的评价资料这4点。为了克服这样的问题，提供用来对研究目的和临床应用(细胞疗法等)的使用足够量的褐色脂肪细胞，从兼具无限自我增殖能力和多能性分化能力的多能干细胞制备褐色脂肪细胞极为有用。作为人多能干细胞，可将人胚胎干细胞(ES细胞)、人诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem(iPS)细胞)作为通用性最高的细胞举出，然而还没有使用这些人多能干细胞成功制备褐色脂肪细胞的例子。另一方面，有关于从小鼠的骨髓、皮肤、脂肪组织中存在的成体干细胞制备褐色脂肪细胞，以及从小鼠ES细胞制备褐色脂肪细胞的报道(专利文献1)，其对利用体外试验的褐色脂肪细胞制备的确认是仅通过UCPl基因的信号表达来进行的，未调查对褐色脂肪细胞功能表达重要的其他基因群(PRDM16、EL0VL3、CIDE-A、PPARa等本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.27 JP 2011-100218;2011.11.30 JP 2011-262841.一种源自多能干细胞的褐色脂肪细胞的制造方法，其是使用多能干细胞制造褐色脂肪细胞的方法，其特征在于， 通过包括工序(A)的方法，由多能干细胞形成细胞凝聚物,通过包括工序(B)的方法，由细胞凝聚物得到褐色脂肪细胞； (A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序， (B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。2.一种源自多能干细胞的细胞凝聚物的制造方法，其是使用多能干细胞制造细胞凝聚物的方法，其特征在于， 通过包括工序(A)的方法，由多能干细胞得到细胞凝聚物； (A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序。3.一种源自多能干细胞的褐色脂肪细胞的制造方法，其是使用源自多能干细胞的细胞凝聚物制造褐色脂肪细胞的方法，其特征在于， 通过包括工序(B)的方法，由源自多能干细胞的细胞凝聚物得到褐色脂肪细胞； (B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。`4.如权利要求1或2所述的方法，其中，工序(A)中使用的造血性细胞因子为BMP4、VEGF, SCF、Flt3L、IL6、IGF2 中的任一种。5.如权利要求1或3所述的方法，其中，工序(B)中使用的造血性细胞因子为BMP7、VEGF、SCF、Flt3L、IL6、IGF2 中的任一种。6.如权利要求1~5中任一项所述的制造方法，其中，多能干细胞使用ES细胞或iPS细胞。7.如权利要求6所述的制造方法，其中，iPS细胞使用通过仙台病毒载体建立的iPS细胞。8.如权利要求1~7中任一项所述的制造方法，其中，多能干细胞使用人多能干细胞。9.一种源自多能干细胞的褐色脂肪细胞，其是使用多能干细胞制造的褐色脂肪细胞，其特征在于， 其是通过包括工序(A)、(B)的方法得到的； (A)将多能干细胞在无血清环境中在造血性细胞因子的存在下进行非粘附培养，制备细胞凝聚物的工序， (B)将细胞凝聚物在造血性细胞因子的存在下进行粘附培养，制备褐色脂肪细胞的工序。...
【专利技术属性】
技术研发人员：佐伯久美子，汤尾明，西尾美和子，川崎正子，佐伯晃一，长谷川护，
申请(专利权)人：独立行政法人国立国际医疗研究中心，生物载体株式会社，
类型：
国别省市：
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