利用异源基因表达来调节细胞分化能力的方法。本发明专利技术的一些实施方案涉及通过将重编程因子递送至细胞从而诱导出心脏祖细胞的方法，其中所述重编程因子包含ETS2或者ETS2与Mesp1的组合。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请要求享有2010年3月5日提交的、名称为“ETS2 AND MESP1GENERATECARDIAC PROGENITORS FROM FIBROBLASTS”的美国临时专利申请系列号61/339，509的优先权,其全部内容通过引用并入本文。本专利技术的一个方面一般地涉及细胞分化领域，更特别地涉及通过成纤维细胞的分离、更新以及定向分化为特定的成熟的心脏细胞类型、起搏细胞类型、平滑肌细胞类型和内皮细胞类型从而使心血管组织再生的策略。
技术介绍
哺乳动物心脏组织的损伤常常导致大量心脏细胞(包括成熟的心脏细胞、起搏细胞、平滑肌细胞和内皮细胞)损失。尽管有迹象表明，心脏细胞能够在人中再生(Bergmann等，2009)，但是其机制并不清楚，并且该过程对于修复常见类型的心脏损伤(例如缺血、梗塞、创伤或者由于毒素或病毒感染引起的伤害)来说似乎进行得不够快。因此，实验性心脏药物的中心目标是研发使由于心脏损伤而损失的心脏细胞再生的方法。已进行了对胚胎心脏发生机制的研究，其目标是在体外或体内复制心脏发生过程，以达到使受损组织再生的目的。最近的研究已鉴定出多能(Isll+)心血管祖细胞(multipotent (Isll+)cardiovascular progenitor, MICP)细胞,其能够分化形成成熟的心脏组织。已分离了来源于胚胎干细胞(embryonic stem (ES) cell)的MICP细胞,其能够产生内皮细胞、心脏细胞和平滑肌细胞(Moretti等，2006)。基因研究已表明，这些MICP细胞表达Isll、Nkx2. 5和Flkl0研究心脏发生的模型系统包括海鞘类玻璃海鞘(Ciona intestinalis) (Beh等，2007)。谱系研究已显示，成年玻璃海鞘的心脏来源于两种表达Ci-Mesp(碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子)以及 Ci-Estl/2 的起始细胞(founder cell) (Imai 等,2004 ；Satou等,2004) ο此外，还表达保守的心脏特化基因NK4 (tinman nkx2. 5)、GATAa(pannier/GATA4/5/6)、Hand 和 Hand 样的海銷类直系同源物(Imai 等,2003 ；Davidson, 2007 ；Davidson和Levine, 2003 ；Satou等，2004)。Ci-Mesp敲低的胚胎不发育出心脏原基(primordia)，并且对Etsl/2活性的靶向抑制还阻断了心脏特化和心脏区的扩展。类似地，Ci-Mesp、Mespl、Mesp2的鼠同源物表达于定向为颉骨-心脏中胚层的早期中胚层中(Saga等,2000)。只有Mespl/Mesp2双敲除的小鼠缺乏心脏中胚层(Saga等，1999 ;Kitajima等，2000)，这表明这些基因在指导高等脊椎动物中出现心脏祖细胞中发挥作用。Mesp基因的冗余使得胚胎中的进一步研究成为艰难的任务。本领域中所需的是诱导心脏发生的方法，以实现心脏细胞再生从而用于治疗受损心脏组织的目的。Yamanaka、Thomson和Daley小组已报道了利用有限数目的、对于保持自我更新和多能性来说重要的转录因子使人的体细胞重编程为多能细胞(Takahashi等，2007 ;Yu等，2007 ;Park等，2008)。本专利技术的一个方面提供了使体细胞重编程以及定向分化为心脏祖细胞的方法。因此，本申请的一个实施方案提供了测试如下独特的调节模式的方法，在所述调节模式中，ETS2和Mespl是转化性的(transformative)(这与NKX2. 5和ISLl不同)，其将非胚胎的正常人皮肤成纤维细胞(normal human dermal fibroblast, NHDF)转变为初级心脏祖细胞。本申请的另一个方面是阐述Mespl在指导心脏祖细胞出现的调节层次中的作用。概述本专利技术的一个实施方案涉及使用异源基因表达来调节细胞分化能力。本专利技术的一些实施方案涉及通过将重编程因子(reprogramming factor)递送至细胞从而诱导出心脏祖细胞的方法，其中所述重编程因子包含ETS2或者ETS2与Mespl的组合。本专利技术的另一个实施方案提供了通过使体细胞重编程而诱导出的心脏祖细胞，其中所述重编程包括将包含ETS2基因的重编程因子递送至体细胞。所述体细胞可以是正常 人皮肤成纤维细胞(NHDF)，所述重编程因子可以是ETS2或Mespl或者其组合。本专利技术的又一个实施方案提供了使体细胞重编程以产生心脏祖细胞的方法，其中所述重编程包括将包含ETS2基因的重编程因子递送至体细胞。所述体细胞可以是NHDF，所述重编程因子可以是ETS2或Mespl或者其组合。附图说明以下附图构成本说明书的一部分，其进一步表明本专利技术的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合本文中对特定实施方案的详细描述，可更好地理解本专利技术。图I显示插入了 ETS2和ELK4全长DNA编码序列的慢病毒示意图。功能性元件和缩写组成型Ef-Ia启动子、多克隆位点(multiple cloning site, MCS)、来自人脊髓灰质炎病毒的内部核糖体进入位点(independent ribosome entry site, IRES)、增强型绿色突光蛋白(eGFP)的编码序列、旱獭肝炎病毒转录后调节元件(Woodchuck HepatitisPosttranscriptional Regulatory Element, WPRE)、活化结构域(activation domain,AD)、DNA结合ETS结构域。这些质粒通过标准的重组DNA克隆技术得到，随后用于制备慢病毒，以感染正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)；图2显示(上图)经空慢病毒(pWPI-GFP)、pWPI-ELK4_GFP慢病毒或PWPI-ETS2-GFP慢病毒处理的NHDF，以及(下图)经空病毒、携带ETS2的病毒、携带ELK4的病毒感染的细胞或者未感染的第3代NHDF(NHDF-P3)中GAPDH、NANOG, 0CT3/4、S0X2的表达水平；图3显示使用针对干细胞标志物NANOG的抗体在经携带ETS2 (而非ELK4或空载体)之慢病毒感染的NHDF-P3细胞中的免疫荧光染色(上图)。使用抗ETS2抗体进行的蛋白质印迹显示，经携带ETS2之慢病毒感染4周的NHDF中表达ETS2，而经空慢病毒感染的NHDF显示无表达(左下图)。利用抗ETS2抗体进行的免疫荧光染色证实了经ETS2慢病毒感染之细胞中的诱导表达(右下图)；图4显示培养4周后干细胞样集落中干细胞标志物NAN0G、0CT3/4，S0X2、REX1和c-MYC的诱导。荧光颜色(图中未显示颜色)如下DAPI (蓝色)、GFP (绿色)、NANOG和0CT3/4(红色)，所有这三种颜色的混合见于“合并”图中。依要求可以提供彩色荧光图像。图5显示表明H9人胚胎干细胞(A)、未感染的NHDF(B)或经ETS-2感染的细胞(C)的百分比的流式细胞图，其中对干细胞表面标志物SSEA-3进行染色。阴性对照，黑线；SSEA-3染色，灰线；图6显示表明H9人胚胎干细胞(A)、未感染的NHDF (B)或经ETS-2感染的细胞(C)本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.05 US 61/339,5091.通过使体细胞重编程而诱导出的心脏祖细胞，其中所述重编程包括将包含ETS2基因的重编程因子递送至所述体细胞。2.权利要求I的心脏祖细胞，其中所述ETS2基因包含具有SEQID NO 9的DNA序列。3.权利要求I的心脏祖细胞，其中所述体细胞是人细胞。4.权利要求I的心脏祖细胞，其中所述体细胞是正常人皮肤成纤维细胞。5.权利要求I的心脏祖细胞，其中所述重编程因子还包含ETS2。6.权利要求I的心脏祖细胞，其中所述重编程因子还包含Mespl。7.权利要求I的心脏祖细胞，其中所述Mespl基因包含具有SEQID NO :6的DNA序列。8.权利要求I的心脏祖细胞，其中所述重编程因子通过引入包含...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特·J·施瓦茨，弗拉基米尔·N·波塔曼，乔斯·弗朗西斯科·伊斯拉斯，
申请(专利权)人：德克萨斯心脏研究所，休斯敦大学，德克萨斯AM大学系统，
类型：
国别省市：
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