人类免疫系统的动物模型及产生它的方法技术方案

本发明专利技术涉及在非人类哺乳动物中建立可操作的适应性的人类免疫系统的方法。本发明专利技术的系统特征在于以下步骤：ａ）将具有造血潜能的人类干细胞移植到非人类哺乳动物中，以及ｂ）使用人类细胞系、细胞和／或组织培养物的细胞培养上清液调制非人类哺乳动物，和任选的ｃ）使用无独立造血潜能的支持细胞。如此建立的动物模型包含造血系统的人类具有免疫能力的细胞，所述细胞尤其包括Ｔ和Ｂ细胞，单核细胞，树突细胞，ＮＫ细胞，粒细胞和ＣＤ３４↑［＋］干细胞。如此建立的免疫系统的反应性尤其基于人Ｔ和Ｂ淋巴细胞与树突细胞的合作。本发明专利技术的动物模型具有长期的稳定性，适于诊断目的，适于研究，适于开发和检测治疗，或适于开发产品，例如生产人类抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在适合的动物模型中建立功能性适应性人类免疫系统 的方法，以及通过该方法产生的动物模型。该动物模型适合用于例如 临床前药理学研究以及人类抗体的生产。优选情况下，几乎不能对移 植的细胞发展出任何免疫反应的免疫缺陷小鼠可以用于此目的。医学治疗特别是再生医学领域中的基本策略和技术，其特点通常 在于动物模型(例如通过使用啮齿动物)。但是，当将用这种方法获得的原理使用于人类的临床应用时，通常难以界定治疗产品或治疗策 略是否对于人类靶是最适的。因此，有两种可能性a)在临床应用中 人类靶是有病的，或b)治疗药剂不具有同样的功能性质。这对于肿瘤 或移植疗法(尤其是干细胞移植)来说是特别有关联的，在利用种-特 异性单克隆或多克隆抗体制剂的免疫疗法中也受到特别的关注。制药 公司面临着这样的挑战，即只有10。/。的在临床研究中试验的活性成分 最终能够产生新的被批准的药物。为了验证以及接受新的技术或工作 策略，需要临床前的模型和工具，在其中可以在尽可能复杂的系统生 物学背景中研究人类细胞和组织。就此而论，其中的人类免疫系统细 胞可以彼此反应而不被排斥的免疫缺陷小鼠可以提供一个解答，因为 它们将小动物模型的优点和与改进的临床病症相关性结合起来了 。到 目前为止，已经实现了两种在啮齿动物中开发相应动物模型的策略。第一种策略利用了用于产生遗传修饰(转基因、敲除、敲入)动 物的技术，通过诱导特定的突变或用同源的人类基因替换鼠类基因， 将人类基因导入体细胞或生殖细胞，以模拟遗传修饰或表达人类抗原 或耙。除了花费高和成功率低之外，这种方法的局限性还特别在于通常只产生单个人类性质、以及它们通常与动物配体分子的反应性以及 通常与不一致的基因表达控制机制的反应性。因此，该方法通常专门用于对活性成分在活性成分的代谢以及毒性的确定方面进行定性，或 用于检测单个靶或一组靶的活性(1; 2)。第二种也是更复杂的途径是通过异体移植产生嵌合体(3)。这包 括在通常是免疫缺陷的动物中使用人类细胞或组织。用于产生人类免 疫系统的良好的宿主动物是在适应性免疫中有几个缺陷的小鼠株系， 例女口 Rag2-〃y; (4)、 BNX或NOD/SCID B2m"un株系。NOD/SCID (非 肥胖型糖尿病/严重合并免疫缺陷)小鼠的不同株系被用作人源化的标 准模型。它们基本上通过下面的免疫缺陷性质进行定性完全失去B 淋巴细胞和T淋巴细胞、NK细胞数量减少、抗原呈递细胞的分化和功 能缺陷、以及缺少循环补体。这些小鼠比野生型更易受电离辐射的影 响，它们在DNA修复系统中有缺陷。在移植了人类造血干细胞、分化 的造血细胞以及淋巴器官后，在免疫缺陷动物中形成人类血细胞生成 单个株系或几个株系是可能的。根据所用的小鼠株系及其调理以及造 血干细胞的数量和来源的不同，在动物的外周血或脾脏和骨髓中发育 出0.1到90%的人类CD45+细胞是可能的。缺点是血细胞生成重建的高度可变性。此外，根据小鼠的株系和 动物调理的不同，表现的个体人类细胞类型不同。NOD/SCID小鼠的特 征是优选的并且几乎专门生长B细胞。人类B淋巴细胞表现出典型形 式的免疫球蛋白基因重排(6)，在使用人类胎儿、脐带血或成年淋巴 祖细胞后产生了多样性的免疫球蛋白库(7)。循环T细胞没有或仅以 极小量形成，并且形成滞后。只有在用重组的肿瘤坏死因子预处理动 物并使用大量单核细胞后，才能检测到T-淋巴细胞的快速和强烈的发 育(8)。但是，人类移植移植物与动物组中有非常高的差异。对人类 T-细胞的表现型进行定型研究显示出，尽管具有可变性，根据使用的干 细胞来源的不同，CD4/CD8的比值是1:1或1:2。细胞具有多样化的 T-细胞受体库。在使用PHA或IL-2的体外增殖研究中对这些T-细胞进 行的初步功能分析显示出它们可以被活化，但是仅仅是非常低的水平。 U.S. 6,627,792 B2利用了被操作的病人的肋骨组织切片，将其通过皮下注入腹膜腔内，成功地重建了 T-细胞。它们的可用性和伦理学考虑限 制了其应用。在静脉内注射了该骨组织的个体细胞悬浮液后，人类的嵌合现象非常低，几乎不能检测到T-细胞。U.S. 6,060,643利用了 G-CSF 调动的外周血(PB)、胎儿和成人骨髓(FBM、 ABM)在BNX小鼠 中重建人类造血细胞。在移植了PB或ABM后6-8周后，只有17%或 4.7%的小鼠是嵌合的，变化性极高。使用FBM后没有获得嵌合。不 到3%或15%的接受了 PB或ABM或FBM移植的动物被证实显示出长 期的移植现象。接受PB的动物在30天后平均存活率为25。/。。这可能 与自反应细胞形成或调节活性细胞种群没有发育有关。只有在使用成 年供体的外周血之后才发现移植物抗宿主疾病的清晰特征(9)。这说 明了到目前为止人类细胞在动物模型背景中功能潜力不能令人满意。到目前为止，在移植了人类脐带血单核细胞后，发现巨噬细胞树 突状细胞类型的人类细胞仅仅是不成熟的CD34— HLA-DR+ CD4+树突 状细胞前体(DC)。在NOD/SCID小鼠的淋巴器官中没有检测到成熟 的DCs (10)。尽管在动物模型中DCs向成熟细胞的分化被阻断了， 在体外条件下成熟的DCs被证明在混合的白细胞反应中是有效的刺激 物。Cravens等(11)证实了在NOD/SCID小鼠中不添加细胞因子的 情况下人类成熟和反应性DCs的发育。细胞对体外LPS刺激作出反应， 导致细胞因子IL-8、 TNF-a、 IL-10以及IL-12p70的大量分泌。IL-1J3、 IL-6和IFNY的释放相对较低。然而，这些细胞因子是人类系统中急性 或全身性感染的特征。因此，还需要进一步开发出其中的细胞因子产 生情况可以与目标人类系统相比较的系统。综上所述，显然目前存在的方法和模型部分地反映出人类造血细 胞的发育和成熟以及它们在动物中的反应性。但是，目前还没有成熟 的方法能够产生标准化的、可重复的、代表了人类的整体、特别是适 应性免疫系统的模型。但是，为了使临床前期的试验更有效并使治疗 失败最小化，绝对需要这种方法。人类特异性治疗或再生药剂的制备 和使用需要有正常功能的人类树突状细胞、T-细胞、B-细胞、NK细胞、单核细胞和粒细胞的存在。因此，本专利技术所解决的问题是提供能够永久性生产不具有现有技 术中已知的缺点的人类特异性嵌合体的新方法。具体来说，本专利技术的 目的是增加在动物中具有造血潜能的细胞的移植物生长的可靠性，以 及最小化再生结果的个体间差异。通过这种方式，提供了能够具有可 比的反应形式和强度纯系的实验组的条件。此外，本专利技术的目的是以均衡的方式永久地生产造血系统的所有 细胞，以及在动物中分别发育出细胞典型的反应形式。本专利技术将能够 使人类细胞在动物中以其典型的方式协同作用，并且通过这种方式提 供有功能的人类的，特别是适应性的，免疫系统。嵌合体应该不显示、 或仅显示出最少的移植引起的抗宿主生物体的反应的特征。此外，部 分基于该方法的非常高的动物死亡率(15-65%)应该被最小化。作为这个目标的解决方法，本专利技术提供了利用新的调理宿主动物 方法克服已知解决方案的现有技术缺点的方法。根据本专利技术，目标可以通过在非人类哺乳动物中产生用于人类免 疫系统的动物本文档来自技高网...

【技术保护点】
在非人类哺乳动物中制备用于人类免疫系统的动物模型的方法，包括下列步骤：　　　　ａ）将具有造血潜能的人类干细胞移植到非人类哺乳动物中，以及　　　　ｂ）使用人类细胞系、细胞和／或组织培养物的细胞培养上清液调制非人类哺乳动物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗兰克埃姆里希，芒雅坎普拉德，曼努埃拉阿克曼，
申请(专利权)人：莱比锡大学，
类型：发明
国别省市：DE[德国]