福尔马林固定组织的蛋白质抽提制造技术

本发明专利技术涉及能溶解，随后定量测定福尔马林固定生物学样品中的完整蛋白质的方法。该方法能提取这些样品的全长蛋白质，随后对其进行分析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】福尔马林固定组织的蛋白质抽提本专利技术涉及溶解，随后定量测定蛋白质，特别是来自福尔马林固定的生物学 样品中的完整全长蛋白质的方法。在许多国家，用福尔马林固定组织然后进行组织病理学检测是一种标准方法， 其目的是为了，例如区分健康组织和患病组织。几十年来， 一直收集福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的组织，其是许多诊断研究的来源。可使用来自大多数器官、不 同患病阶段、治疗前/期间/后的组织。FFPE组织的优点在于可以高度保留形态。 然而由于发生交联，不能准确的研究大分子(DNA、 RNA、蛋白质)。根据目前的观 点，福尔马林固定的组织不适用于常规且可靠地分离足量的蛋白质，以用于随后定 量(例如，Espina等，2003)。因此，人们正寻求替代福尔马林固定组织随后定量 测定大分子的方法。其中，这里述及的是冷冻组织(低温切片)和目前讨论的实验性 方法，例如70%乙醇(如Ahram等，2003)。冷冻物质是优良的大分子来源，但该 组织的收集、加工和储存是昂贵的。这些实验性固定方法是维持大分子的形态和完 整性的良好折衷方法；然而，它们在回顾性硏究中没什么大作用。在大型回顾性和前瞻性研究中，必须在蛋白质水平检验人基因组项目所鉴定 的候选分子的临床适用性。以前认为不可能用福尔马林固定的物质进行DNA和 RNA分析。如今，这种分析是惯常的，甚至在激光支持组织显微切片后也可行。 同样的物质也适用于蛋白质分析。分离核酸的方法与分离蛋白质的方法极为不同。 例如，蛋白质分离中不用蛋白酶，因为这样蛋白质会被消化，从而不再完整。对于 这点，可认为表达病理学方法(WO 2004/080579 A2)是精确的，其联用蛋白酶和 热效应来分离蛋白水解片段-即，肽。然后通过质谱法分析这些片段。因此，表 达病理学方法与本文所述方法不同。充分的热处理可破坏蛋白质交联键(福尔马 林所造成的)。以下是该方面的已知例子。(1)染色质免疫沉淀(ChiP). ChiP是能检测靶蛋白在体内是否与某些DNA序 列结合的方法。用福尔马林固定完整的细胞从而导致DNA-蛋白质发生交联以及蛋白质-蛋白质发生交联。然后裂解细胞，切割DNA将其分裂成较小的片段。然后用 该靶蛋白的抗体免疫沉淀DNA-蛋白质复合物。然后加热使DNA-蛋白质连接键断 裂，用蛋白酶破坏蛋白质。最后，用聚合酶链式反应(PCR)确认用特定的抗体是否 共同免疫沉淀了某DNA序列。在这里，热作用是使福尔马林导致的交联断裂的原 理。(2)抗原回收.抗原经过福尔马林固定后常丧失其免疫反应性。因此，使用许 多抗体的免疫组织学研究只在一定范围内可能。目前可行的方法能恢复大多数抗原 的免疫反应性(抗体回收)。其中的原理是在组织切片脱石蜡和再水化后，加热水溶 液中的组织。然而，定量测定免疫组织化学反应只在一定范围内可能。制备生物分子裂解液的方法见WO 2004/080579 A2，该方法在缓冲液系统中 再次加热福尔马林固定的组织样品，然后用蛋白水解酶处理以降解该组织。然而，目前没有方法能用现代方法定量且灵敏地可靠研究福尔马林固定组织 中的完整蛋白质。免疫组织化学(IHC)(测定组织切片中各细胞的免疫反应性和分配) 是目前研究福尔马林固定组织中蛋白质的唯一方法。然而，IHC只能在一定范围内 定量。福尔马林固定确实良好地维持了组织的形态，但导致蛋白质彼此和与其它大 分子，例如DNA严重交联。以前从福尔马林固定的组织分离蛋白质的努力(例如 Ahram等，2003)不成功，因为这些方法得到的蛋白质产率一般很差，不可靠，只 限于蛋白质印迹研究(例如，Ikeda等，1998)并且经常不能检测或定量测定完整的 蛋白质。Ikeda等描述了实际上适用于分离FFPE组织的蛋白质的方法，但该方 法不能定量分离。其原因是6(TC的温育步骤明显不足以定量分离蛋白质。必须 能定量测定最小的固定组织样品，例如生物活检样品中的蛋白质。采用目前的 方法不能从这种样品中分离足够量的蛋白质，例如用于蛋白质阵列测定。因此， 这些方法不适用于日常常规临床方法来测定疾病标记。不只是蛋白质印迹对于 从福尔马林固定的组织定量测定蛋白质的要求增加，临床或研究也是。目前开 发的高通量方法，例如蛋白质阵列正变得极其重要。目前认为用蛋白质阵列不 能检测福尔马林固定组织中的完整蛋白质(Espina等，2003)。因此，本专利技术(要解决)的问题是提供一种改进的方法从福尔马林固定的生物学 样品中提取蛋白质。通过以下方法从福尔马林固定的生物学样品定量提取蛋白质解决了该问题，该方法是在足以释放蛋白质的温度下在缓冲液中温育生物学样品，其中所述缓冲液 含有去污剂和无蛋白水解活性的化合物，先加热缓冲液中的生物学样品，然后在高于6(TC的温度下再次温育。本专利技术的其它改进之处见各从属权利要求。本文描述的专利技术涉及从固定的生物学样品，例如组织样品中提取蛋白质用于 随后的分析，特别是定量测定蛋白质的明显优化方法，该方法与目前临床和实验性 研究的高通量方法，例如蛋白质阵列相容。这样则易于通过抗体检测分析和定量测 定不同疾病状态或过程的样品。出乎意料的是，本专利技术从福尔马林固定组织提取蛋白质的方法能提供优良的结果并避免了现有技术水平的缺点。以前使用的技术明显无法成功，因为(a)样品 的加热太简单(例如，只在10(TC加热.50秒)；或(b)使用蛋白酶(不能分离完整的蛋 白质)；或(c)实际上使用了去污剂，但随后未充分加热样品(例如，不超过60'C， 婴儿蛋白质产率过低)。只有采用本文所述的方法，即例如(a)使用不含蛋白酶的缓 冲液，(b)使用去污剂和(c)较高的加热温度(高于6(TC，长于50秒)才能以出乎意 料的方式获得足够量的完整蛋白质而用于随后的精确定量测定。检测分离的完整蛋白质的其它方法可以是，例如蛋白质印迹、蛋白质阵列、 免疫沉淀、SELDI-TOF质谱法、ELISA和2-D凝胶电泳。下文根据聚体的实施例进一步说明了本专利技术。附图说明图1显示了本专利技术方法临床应用的一个例子。图2举例显示在高于6CTC的温度下温育组织样品提高了蛋白质产率。通过 蛋白质印迹显示与本专利技术方法O60。C，例如80。C，右图)相比，60。C(左图)培育 样品后a-微管蛋白的产率(完整蛋白，50kDa)。图3显示了从福尔马林固定的组织提取后两种蛋白质(E-钙粘蛋白，a-微管 蛋白)的相关性。图4显示了蛋白质印迹(检测蛋白质的完整性，证明抗体特异性)和形式最 简单的反相蛋白质阵列(斑点印迹)之间的相关性。图5显示了用含有不同还原剂的缓冲液提取FFPE切片后p-肌动蛋白的相 关性。采用本专利技术方法可检测和定量测定一种完整的蛋白质或几种完整的蛋白 质。能可靠地分离和定量测定来自完全不同的细胞区室(compartment),例如细胞核、细胞质或细胞膜的蛋白质。可以稀释分离的完整蛋白质，即获得系列稀 释液，从而能建立内标曲线。这样能确保蛋白质的检测和定量测定发生在线性 区域中。如果需要，可以预先采用蛋白质印迹检测蛋白质以确保所用的检测试 剂，例如抗体之间不发生交叉反应(蛋白质印迹中只有大小正确的一条特异性 条带)。通过本文所述方法分离可定量的完整蛋白质以最佳方式补充了日常常规 临床方法中早已实施的免疫组织化学分析的结果。因本文档来自技高网...

【技术保护点】
从福尔马林固定的生物学样品提取蛋白质的方法，该方法是在足以释放所述蛋白质的温度下，在缓冲液中温育所述生物学样品，其特征在于，所述缓冲液含有去污剂，不含蛋白水解活性化合物，首先加热所述缓冲液中的所述生物学样品，然后在高于６０℃的温度再次温育。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P普罗斯维斯基，KF贝克，
申请(专利权)人：恰根有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]