本发明专利技术公开了一种快速提取和纯化福尔马林固定组织中DNA的方法，属于法医学技术领域。该方法包括以下步骤：(1)取福尔马林固定组织，蒸馏水冲洗后破碎组织，用滤纸吸干；(2)加入无水乙醇浸泡1～5分钟，离心，弃去上清；再依次加入浓度70～80％的乙醇和浓度40～60％的乙醇，重复以上步骤，最后留取沉淀；(3)加入细胞裂解液、十二烷基磺酸钠和蛋白酶K，在温度55～65℃下孵化处理，离心，取上清液；(4)在上清液中加入盐，混匀，在温度-4～4℃下静置分层，离心，取上清液；(5)在上清液中加入DNA结合液，混匀，转移到固定有二氧化硅膜的套管内，离心，弃去液体，洗脱DNA，即得。该方法简便易行、无毒副作用，易于推广。
【技术实现步骤摘要】
一种快速提取和纯化福尔马林固定组织中DNA的方法
本专利技术涉及一种快速提取和纯化福尔马林固定组织中DNA的方法，属于法医学技 术领域。
技术介绍
福尔马林固定组织是病理学、法医病理学和法医遗传学等学科进行疾病诊断和案 例分析常用检材，这些标本均需在福尔马林中固定数月乃至数年，作为一种重要的个人实 物档案，为解决涉嫌医疗纠纷、保险欺诈、财产继承等民事或刑事案件提供了一种极为重要 的、可靠的法医物证检材。但是常规提取方法对福尔马林固定组织进行基因分型时，难以获 得稳定、可靠的分型结果，这是由于福尔马林对标本DNA质量和扩增产生影响，导致提取的 标本DNA质量下降，进而使PCR扩增产物的生成及后续的生物学分析变得困难。 福尔马林对DNA分子有4种化学修饰作用：1)核酸甲基化作用，2)由于甲基化作 用而形成的交联，3)诱导形成嘌呤二聚体，4)导致核酸中磷酸二脂键断裂。福尔马林通过 改变标本组织的核酸分子排列导致DNA发生不同程度的降解。影响从福尔马林保存标本中 提取DNA质量的因素包括福尔马林导致的DNA与蛋白质之间、蛋白质与蛋白质之间、DNA与 DNA之间的交联，福尔马林溶液的化学成分、pH值及浓度，标本保存的时间和温度，标本保 存部位等。此外，福尔马林固定标本的DNA降解成不同长度的片段也不利于标本DNA进行 PCR扩增反应。比如小片段DNA与大片段DNA共同竞争Taq聚合酶，而小片段DNA无法进 行有效扩增，因此PCR反应被抑制。福尔马林也会导致DNA中N-糖基水解，产生非嘌呤和 非嘧啶位点，大量的非嘌呤和非嘧啶位点聚集在引物区导致引物与DNA模板无法正常连接 等。 徐来祥等提出了一种从浸泡福尔马林的大仓鼠肝脏和日本鳗鲡肌肉标本中提取 基因组DNA的方法（《福尔马林保存的动物标本基因组DNA的提取方法》，动物学报，2002， 48 (2) : 264?269)。取浸泡于福尔马林中的大仓鼠肝脏或日本鳗鲡肌肉适量，用PBS溶液冲 洗，放在灭菌的吸水纸上将其揩干，于超净工作台内用无菌剪刀将材料剪成50mg的小块， 放入PBS溶液冲洗；然后转入70 %的乙醇中处理12?24h。依次换入下列梯度酒精中处 理：80%乙醇，2h，重复一次；90%乙醇，2h，重复一次；95%乙醇，2h，重复一次；100%乙醇， lh，重复一次。然后将材料放入1/2倍的PBS液中浸泡12h，期间更换一次溶液。提取方法 参考Sambroock等人（1989)，加入蛋白酶K的量按照准量（100iig/mL)，在50?56°C温浴 3?6h处理过程中，不断轻摇混匀，视消化效果可以重复加入标准量的1/2倍蛋白酶K进行 消化，直至将材料完全消化为止；酚氯仿抽提最后依次的上清液移入透析袋中透析；沉淀 DNA时，在-20°C下20min效果为宜。该方法的主要特点在于对标本进行预处理，在保证不使 DNA进一步降解的前提下，首先去除标本中所含的福尔马林成分，然后利用改进的酚氯仿抽 提法提取该类标本的基因组DNA，再进一步用透析法纯化DNA。研究结果表明，采用该方法 提取和纯化被试标本基因组DNA能较好地应用于RAPD、微卫星位点的PCR扩增、Southern 和斑点杂交。然而，尚无法满足法医学实验室需要的基因组DNA。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速提取和纯化福尔马林固定组织中DNA的方法。 为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是： -种快速提取和纯化福尔马林固定组织中DNA的方法，包括以下步骤： (1)取福尔马林固定组织，蒸馏水冲洗后破碎组织，用滤纸吸干； (2)在步骤（1)的组织中加入无水乙醇浸泡1?5分钟，离心，弃去上清；再依次 加入浓度70?80 %的乙醇和浓度40?60 %的乙醇，重复以上步骤，最后留取沉淀； (3)在步骤（2)留取的沉淀中加入细胞裂解液、十二烷基磺酸钠和蛋白酶K，在温 度55?65°C下孵化处理，离心，取上清液； (4)在步骤（3)的上清液中加入盐，混匀，在温度-4?4°C下静置分层，离心，取上 清液； (5)在步骤（4)的上清液中加入DNA结合液，混匀，转移到固定有二氧化硅膜的套 管内，离心，弃去液体，洗脱DNA，即得。 所述步骤（2)中浸泡时可轻微震荡，保证乙醇充分接触破碎的组织。 所述步骤⑵中离心的转速为10000?12000rpm，离心时间3?5分钟。 所述步骤（2)中留取沉淀后自然晾置3?5分钟，以使乙醇充分发挥。 所述步骤（3)中细胞裂解液组成为：NaCl0? 4mol/L、Tris-HCl0? 01mol/L、EDTA 0? 002mol/L，余量为水。 所述步骤⑶中当十二烷基磺酸钠浓度取10%、蛋白酶K取20mg/mL时，细胞裂 解液与十二烷基磺酸钠、蛋白酶K的体积比为40:2:1。如当固定组织的质量为20?30mg 时，细胞裂解液取400yL，10 %十二烷基磺酸钠取20yL，20mg/mL蛋白酶K取10iiL。 所述步骤（3)中孵化处理的时间为8?10小时，直至溶液清亮。 所述步骤（3)中孵化处理后在室温下放置（如15?30分钟），待自然降至室温。 所述步骤⑶中离心的转速为11000?15000rpm，离心时间8?15分钟。 所述步骤（4)中盐为氯化钠，如高浓度的氯化钠溶液，5mol/LNaCl。 所述步骤⑷中静置的时间为5?15分钟，待出现分层。 所述步骤（4)中静置的温度优选为0°C。 所述步骤（5)中DNA结合液组成为：5mol/L盐酸胍，35%乙醇。 所述步骤（5)中二氧化硅膜及套管为市售商品（二氧化硅膜制备试剂盒），购自杭 州维特洁生化技术有限公司。 所述步骤（5)中离心的转速为3000?4000rpm，离心时间1?5分钟。 所述步骤（5)中在洗脱DNA前，需采用浓度70?80%乙醇洗涤套管，再用蒸馏水 洗脱DNA。如加入75%乙醇，涡旋振荡后弃去液体（重复操作1次），再加入蒸馏水，离心洗 脱DNA，离心的转速为12000?18000rpm，离心时间1?5分钟。 所述步骤（5)中经洗脱的DNA置于-20?4°C保存备用。 本专利技术的有益效果： 本专利技术提取和纯化福尔马林固定组织中DNA的方法简便易行、无毒副作用，易于 推广，满足法医学实验室的需求。采用该方法获得DNA可用于STR复合扩增。同时，本专利技术 在去除固定组织所含福尔马林成分的操作中，采用浓度由高到低的乙醇进行处理，对甲醛 的去除效果较好。 【附图说明】 图1为本专利技术试验例中福尔马林固定组织提取DNA经STR复合扩增分毛细管电泳 图； 图2为试验例中与固定组织同一个体指血DNA经STR复合扩增分毛细管电泳图； 图3为试验例中阳性对照STR复合扩增分毛细管电泳图（9947A); 图4为试验例中阴性对照STR复合扩增分毛细管电泳图； 图5为试验例中等位基因分型标准物（IDLadder)。 【具体实施方式】 下述实施例仅对本专利技术作进一步详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。 实施例1 本实施例中快速提取和纯化福尔马林固定组织中DNA的方法，包括以下本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速提取和纯化福尔马林固定组织中DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取福尔马林固定组织，蒸馏水冲洗后破碎组织，用滤纸吸干；(2)在步骤(1)的组织中加入无水乙醇浸泡1～5分钟，离心，弃去上清；再依次加入浓度70～80％的乙醇和浓度40～60％的乙醇，重复以上步骤，最后留取沉淀；(3)在步骤(2)留取的沉淀中加入细胞裂解液、十二烷基磺酸钠和蛋白酶K，在温度55～65℃下孵化处理，离心，取上清液；(4)在步骤(3)的上清液中加入盐，混匀，在温度‑4～4℃下静置分层，离心，取上清液；(5)在步骤(4)的上清液中加入DNA结合液，混匀，转移到固定有二氧化硅膜的套管内，离心，弃去液体，洗脱DNA，即得。
【技术特征摘要】
1. 一种快速提取和纯化福尔马林固定组织中DNA的方法，其特征在于：包括以下步 骤： (1) 取福尔马林固定组织，蒸馏水冲洗后破碎组织，用滤纸吸干； (2) 在步骤（1)的组织中加入无水乙醇浸泡1?5分钟，离心，弃去上清；再依次加入 浓度70?80%的乙醇和浓度40?60%的乙醇，重复以上步骤，最后留取沉淀； (3) 在步骤（2)留取的沉淀中加入细胞裂解液、十二烷基磺酸钠和蛋白酶K，在温度 55?65°C下孵化处理，离心，取上清液； (4) 在步骤（3)的上清液中加入盐，混匀，在温度-4?4°C下静置分层，离心，取上清 液； (5) 在步骤（4)的上清液中加入DNA结合液，混匀，转移到固定有二氧化硅膜的套管内， 离心，弃去液体，洗脱DNA，即得。2. 根据权利要求1所述的快速提取和纯化福尔马林固定组织中DNA的方法，其特征在 于：所述步骤（2)中离心的转速为10000?12000rpm，离心时间3?5分钟。3. 根据权利要求1所述的快速提取和纯化福尔马林固定组织中DNA的方法，其特征 在于：所述步骤⑶中细胞裂解液组成为：NaCl 0. 4mol/L、Tris-HCl 0. 01mol/L、EDTA 0? 002mol/...
【专利技术属性】
技术研发人员：翟仙敦，莫耀南，秦豪杰，张振芳，薛小琦，赵贵森，艾红伟，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
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