从福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中检测基因表达的方法技术

本申请公开了一种从福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法，所述方法包括将福尔马林固定石蜡包埋的组织样品用脱蜡液处理以获得脱蜡的组织样品，将所述脱蜡的组织样品裂解以获得组织样品裂解液，和直接检测所述裂解液中的基因表达。

【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及检测基因表达的方法，特别涉及从福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法。
技术介绍
人类基因组DNA全序列数据的公布标志着生命科学发展已逐步进入基因组学时代。随着分子生物学的充分发展，以核酸为主要研究对象的分子生物学技术越来越广泛地被人类用于疾病诊断的领域，为疾病的预防、预测、诊断和治疗提供信息和决策依据。福尔马林固定石蜡包埋组织(formalinfixedandparaffinembeddedtissues，简称FFPE)作为医疗机构最常用的保存病理组织的方法，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。由于新鲜标本难以得到，为进行实体肿瘤分子生物学研究，对已有病例进行回顾性研究时，只能从石蜡包埋组织中进行基因提取，因此石蜡包埋组织就成为来源最丰富的珍贵资源。目前检测FFPE样品中的基因表达需要从FFPE样品中分离出高质量的RNA。但是，由于FFPE样品中RNA已经部分降解了，并且往往与组蛋白紧密交联，因此想要提取其中的核酸信息相当有难度。目前常用的从FFPE样品中提取总RNA的方法耗时长，并且繁杂的纯化步骤造成RNA样品的大量损失，当样品含量有限时，则可能影响下游检测的进行。因此，需要开发一种简单，快速，准确的方法从FFPE样品中检测基因的表达情况。专利技术概述本申请的一个方面特别涉及从福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法，包括：(a)将福尔马林固定石蜡包埋的组织样品用脱蜡液处理以获得脱蜡的组织样品；(b)将所述脱蜡的组织样品裂解以获得组织样品裂解液；和(c)直接检测所述裂解液中的基因表达。在某些实施方式中，步骤(c)包括直接检测所述裂解液中的所述基因的mRNA。在某些实施方式中，步骤(c)包括：提供由报告探针和捕获探针组成的探针对，其中所述报告探针包含(1)与所述基因的mRNA杂交的第一核酸序列；(2)连接在所述第一核酸序列上的荧光标记条形码；其中所述捕获探针包含(1)与所述基因的mRNA杂交的第二核酸序列；(2)连接在所述第二核酸序列上的生物素；将所述探针对与所述基因的mRNA杂交形成复合物；将所述复合物以延伸的状态固定在具有亲和素的基板上；检测荧光标记条形码的信号计数。在某些实施方式中，在步骤(c)中使用nCounter分析系统检测所述裂解液的基因表达。在某些实施方式中，所述福尔马林固定石蜡包埋的组织样品为微量组织样品。在某些实施例中，所述福尔马林固定石蜡包埋的组织样品为细针穿刺活检样品。在某些实施例中，所述福尔马林固定石蜡包埋的样品的体积大于0.75×10-2mm3。在某些实施例中，所述福尔马林固定石蜡包埋的样品的体积大于1.5×10-2mm3。在某些实施例中，所述福尔马林固定石蜡包埋的样品的体积大于3×10-2mm3。在某些实施例中，所述福尔马林固定石蜡包埋的样品的体积大于6×10-2mm3。在某些实施例中，所述福尔马林固定石蜡包埋的样品的体积大于12×10-2mm3。在某些实施方式中，所述脱蜡液包含二甲苯。在某些实施方式中，在步骤(b)中使用蛋白酶k将所述脱蜡的组织样品裂解。在某些实施方式中，将所述裂解液在步骤(c)之前用脱氧核酸酶处理。在某些实施方式中，所述福尔马林固定石蜡包埋的组织样品是人组织样品。在某些实施方式中，所述人组织样品是来源于病人的病理组织样品。在某些实施方式中，所述病理组织样品是肿瘤组织样品。在某些实施方式中，所述肿瘤组织来源于选自下组的肿瘤：小细胞或非小细胞性肺癌、胃癌、肠癌、食道癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、泌尿道癌、肾癌、膀胱癌、恶性黑素瘤、肝癌、子宫癌、胰腺癌、骨髓瘤癌、子宫内膜癌、头颈癌、小儿肿瘤、肉瘤。在某些实施方式中，所述基因为ALK。附图的简要说明图1.从异种移植FFPE组织样品中快速检测基因表达情况。针对同一组织样品的同一基因(ALK)，用裂解液直接检测得到的计数信号约为用纯化的总RNA检测得到的信号的2倍。图2.用裂解液检测基因表达情况。在肺癌腺癌临床样品上大量重复裂解液制备实验，并与500ng纯化的总RNA实验结果进行比对，结果显示两者一致性非常高(R2＝0.946)。图3.用裂解液检测微量组织样品中的基因表达情况。从相同面积、相同样品的FFPE组织中制备裂解液和纯化的总RNA(使用RNeasyFFPEKit(Qiagen))。当组织样品体积约为6×10-2mm3时，使用纯化的总RNA得到的信号接近背景信号的阈值(60)，无法得出准确的测量信息。当组织样品体积小于3×10-2mm3，使用纯化的总RNA得到的信号低于背景信号的阈值。而用裂解液可以准确检测体积为1.5×10-2mm3的FFPE组织样品。专利技术详述本申请公开了一种从福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法，包括以下步骤：(a)将福尔马林固定石蜡包埋的组织样品用脱蜡液处理以获得脱蜡的组织样品；(b)将所述脱蜡的组织样品裂解以获得组织样品裂解液；和(c)直接检测所述裂解液中的基因表达。在本申请中，检测基因表达是指探测由基因的DNA序列产生的对应的基因产物的量，例如mRNA的量。在某些实施方式中，检测基因表达包括检测基因的DNA序列转录得到的mRNA的量。由于RNA转录后的剪切过程可能有所不同，同一个基因可能对应一种或多种不同的mRNA转录子。在某些实施方式中，检测基因表达是检测基因对应的某一种或几种具有特定序列的mRNA转录子的量。在本申请中，“福尔马林固定石蜡包埋”是指用适当的化学试剂固定，脱水并被石蜡侵染的生物样品。在固定过程中，生物样品中的细胞组份迅速凝固和交联，从而得以长期保存。用于固定的化学试剂包括但不限于福尔马林(甲醛)、乙醇、醋酸、升汞、锇酸(四氧化锇)、重铬酸钾及苦味酸或其组合。脱水过程可以包括依次用不同浓度的乙醇(如30％、50％、70％、80％、90％到100％)进行逐级脱水。其他的脱水剂包括但不限于正丁醇、叔丁醇、丙酮。石蜡侵染和包埋的过程为本领域公知。在本申请中，用于检测的组织样品可以包括动物组织样品和植物组织样品。在某些实施方式中，组织样品是人组织样品，优选的是来源于病人的病理组织样品。根据某些实施例，组织样品是肿瘤组织样品。根据某些实施例，肿瘤组织来源于选自下组的肿瘤：小细胞或非小细胞性肺癌、胃癌、肠癌、食道癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、泌尿道癌、肾癌、膀胱癌、恶性黑素瘤、肝癌、子宫癌、胰腺癌、骨髓瘤癌、子宫内膜癌、头颈癌、小儿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法，包括以下步骤：(a)将福尔马林固定石蜡包埋的组织样品用脱蜡液处理以获得脱蜡的组织样品；(b)将所述脱蜡的组织样品裂解以获得组织样品裂解液；和(c)直接检测所述裂解液中的基因表达。

【技术特征摘要】
1.一种从福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法，包括以
下步骤：
(a)将福尔马林固定石蜡包埋的组织样品用脱蜡液处理以获得脱蜡的组织样品；
(b)将所述脱蜡的组织样品裂解以获得组织样品裂解液；和
(c)直接检测所述裂解液中的基因表达。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)包括直接检测所述裂解液中的
所述基因的mRNA。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(c)包括
提供由报告探针和捕获探针组成的探针对，
其中所述报告探针包含(1)与所述基因的mRNA杂交的第一核酸序列；(2)连接
在所述第一核酸序列上的荧光标记条形码；
其中所述捕获探针包含(1)与所述基因的mRNA杂交的第二核酸序列；(2)连接
在所述第二核酸序列上的生物素；
将所述探针对与所述基因的mRNA杂交形成复合物；
将所述复合物以延伸的状态固定在具有亲和素的基板上；
检测荧光标记条形码的信号计数。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中使用nCounter分析系统检
测所述裂解液的基因表达。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述福尔马林固定石蜡包埋的组织样
品为细针穿刺活检样品。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：茅矛，许青，赵伟洁，
申请(专利权)人：上海药明康德新药开发有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31