本发明专利技术公开了结核分枝杆菌非编码RNA的系统发现、标注和功能研究。本发明专利技术通过实验得到结核分枝杆菌潜伏感染者血清中miRNA表达谱，然后通过信息分析得到潜伏感染人群血清中miRNA表达量最高且与正常人群差异最大的4种miRNA。高表达量保证了以此靶标做为检测方法的灵敏度，同时与正常人群差异最大保证了该方法的特异性。基于上述筛选得到的4种miRNA，本发明专利技术构建了一种以小分子RNA为标记物，通过逆转录、实时荧光定量PCR技术对结核病进行诊断的试剂盒。该试剂盒的检测结果准确可靠，操作简便，适于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子诊断领域，具体涉及miRNA作为结核分枝杆菌潜伏感染标记物的应用。
技术介绍
结核分支杆菌引起感染和死亡。世界卫生组织估算全球1/3的人口受结核菌感染,目前结核病控制的三大挑战：多重耐药结核菌(multidrugresistancetuberculosisclebacillus,MDR-TB)的流行以及人类免疫缺陷病毒(humanimmunedeficiencyvirus,HIV)感染、流动人口多,使中国结核病的控制难度巨大。世界卫生组织估计全球约有三分之一的人口，即20亿人是潜伏性感染者。在全球范围内结核病仍是主要传染病之一，每年有约900万例新发患者和200万例死亡患者。对结核病自然史的研究表明，人初次感染结核分枝杆菌后，约有5%的感染者会在2年内发病，而95%人成为潜伏性感染者。结核分枝杆菌潜伏性感染是指宿主感染结核分枝杆菌后未发病，无活动性结核的临床症状、影像学改变和细菌学证据，但PPD试验阳性或干扰素释放试验阳性的一种特殊状态。潜伏性感染者一生中约有5%-10%的概率发展成活动性结核病患者。在结核病低流行地区，对潜伏性感染者者进行筛查和预防性治疗是结核病控制的重要组成部分。这一策略能将潜伏性感染者后续发病的风险降低90%左右。为了进一步提高结核病的诊断、治疗和预防控制水平,现在迫切需要更为精确快速的诊断新技术用于临床标本分离和鉴定结核分支杆菌。
目前临床现有结核病诊断技术根据每种技术所针对的靶标不同可分为三大类。微生物学方法、血清学方法、分子生物学方法。
微生物学方法以涂片和各种培养方法为代表。其中的涂片法比较迅速，一般1个小时可以出结果，但是阳性率只有20%左右。罗氏培养法目前作为结核病诊断的金标准，所需要周期长，一般4-8周，而结核病强化期的治疗是2个月。如果等培养结果出来在对患者进行干预，将会延误治疗；但如果不等培养结果即进行治疗，又可能因为误诊使患者承受抗结核药物副作用所带来的痛苦。
而关于血清学方法，WHO已经发表公开声明，目前市场上所应用的血清学结核病诊断方法都不能取得满意的结果。
目前针对结核分枝杆菌感染状态的方案有两种：PPD和干扰素释放试验。PPD实验简单廉价，但是其敏感性、特异性较低，不能区分卡介苗，而干扰素释放试验诊断效能高，但是其步骤繁琐，价格昂贵难以普及。
分子生物学方法是近来发展比较迅速的一个领域，各种方法都是以结核分枝杆菌的RNA或者DNA为靶标。但是该类方法所面临的问题是未能找到一个另人满意的靶标。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供miRNA作为结核分枝杆菌潜伏感染标记物的应用。
本专利技术所采取的技术方案是：
用于检测小分子RNAhsa-miR-1246和/或hsa-miR-375和/或hsa-miR-30e-5p和/或hsa-miR-410-3p的特异性引物在制备结核分枝杆菌潜伏感染诊断试剂盒中的应用。
检测hsa-miR-1246的引物为：
RT-PCR引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAGGCCA（SEQIDNO.1），
realtime-F：ACACTCCAGCTGGGAATATAACACAGATG（SEQIDNO.2），
realtime-R：TGGTGTCGTGGAGTCG（SEQIDNO.3）；
检测hsa-miR-375的引物为：
RT-PCR引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCACGCGA（SEQIDNO.4），
realtime-F：ACACTCCAGCTGGGTTTGTTCGTTCGGCTC（SEQIDNO.5），
realtime-R：TGGTGTCGTGGAGTCG（SEQIDNO.6）；
检测hsa-miR-30e-5p的引物为：
RT-PCR引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT（SEQIDNO.7），
realtime-F：ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTTGAC（SEQIDNO.8），
realtime-R：TGGTGTCGTGGAGTCG（SEQIDNO.9）；
检测hsa-miR-410-3p的引物为：
RT-PCR引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAGGCCA（SEQIDNO.10），
realtime-F：ACACTCCAGCTGGGAATATAACACAGATG（SEQIDNO.11），
realtime-R：TGGTGTCGTGGAGTCG（SEQIDNO.12）。
一种结核分枝杆菌潜伏感染的诊断试剂盒，其包括检测四种miRNA的特异性PCR引物，其特征在于，所述miRNA包括hsa-miR-1246、hsa-miR-375、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-410-3p。
本专利技术的有益效果是：
本专利技术通过收集临床经干扰素释放试验证实的潜伏感染者血清与正常人群血清，通过全基因组测序技术及生物信息学分析得到结核分枝杆菌潜伏感染者血清中miRNA表达谱，然后通过信息分析得到结核分枝杆菌潜伏感染人群血清中miRNA表达量最高且与正常对照人群差异最大的4种miRNA。高表达量保证了以此靶标做为检测方法的灵敏度，同时与正常对照人群差异最大保证了该方法的特异性。基于上述原则筛选得到的4种miRNA，本专利技术构建了一种以miRNA为标记物，通过逆转录、实时荧光定量PCR技术对结核病进行诊断的试剂盒。该试剂盒的检测结果准确可靠，操作简便，适于推广应用。
附图说明
图1：引物熔解曲线图；
图2：引物熔解曲线图；
图3PCR扩增产物电泳图；
图4实时荧光定量结果；
图5深度测序技术流程；
图6血清标本中RNA的长度分布情况；
图7生物信息学分析图；
图8感染组血清中所有小RNA的表达情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。
一、可用作结核分枝杆菌潜伏感染标记物的小分子RNA的筛选利用Solexa高通量测序技术，分析结核分枝杆菌潜伏感染组和正常人群组血清中SmallRNA表达谱的差异。首先我们分别以两组血清中miRNA表达量降序排列，得到两组血清中表达量最高的前20种miRNA。然后求两组血清中高表达miRNA种类的交集，得到10种在两组样本中表达量最高的miRNA且这10种miRNA在两组样本中的表达差异具有统计学意义。然后我们以fold-change(log2S2/S1)分别到升序和降序排列，然后取前4种miRNA，这样我们就得到了4种（hsa-miR-1246、hsa-miR-375、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-410-3p）在人群血清中表达量最高且在结核分枝杆菌潜伏和正常人群组血清中表达量差异最大的miRNA用于结核分枝杆菌潜伏感染诊断标志物。
材料和方法1.1材料1.1.1样本来源50例结核分枝杆菌潜伏感染者血清由广东省结核病控制中心参比室提供，50例健康志愿者血清取自广东省结核病控制中心生物样本库。
样本采集与保存本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测小分子RNA hsa‑miR‑1246和/或hsa‑miR‑375和/或hsa‑miR‑30e‑5p 和/或hsa‑miR‑410‑3p的特异性引物在制备结核分枝杆菌潜伏感染诊断试剂盒中的应用。
【技术特征摘要】
1.用于检测小分子RNAhsa-miR-1246和/或hsa-miR-375和/或hsa-miR-30e-5p和/或hsa-miR-410-3p的特异性引物在制备结核分枝杆菌潜伏感染诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
检测hsa-miR-1246的引物为：
RT-PCR引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAGGCCA（SEQIDNO.1），
realtime-F：ACACTCCAGCTGGGAATATAACACAGATG（SEQIDNO.2），
realtime-R：TGGTGTCGTGGAGTCG（SEQIDNO.3）；
检测hsa-miR-375的引物为：
RT-PCR引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCACGCGA（SEQIDNO.4），
realtime-F：ACACTCCAGCTGGGTTTGTTCGTTCGGCTC（SEQIDNO.5），
realtime-R：TGGTGTCGTGGAGTCG（SEQIDNO.6）；
【专利技术属性】
技术研发人员：周琳，陈涛，李海成，郭卉欣，
申请(专利权)人：广东省结核病控制中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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