本发明专利技术公开了小菜蛾对阿维菌素靶标抗性的分子检测方法。采用根据小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因序列设计的特异性引物，以提取的小菜蛾单头基因组DNA为模板，进行谷氨酸氯离子通道基因片段的PCR扩增，分析目标片段纯化产物直接测序色谱图即可区分小菜蛾个体的基因型(敏感纯合子SS、抗性杂合子RS和抗性纯合子RR)，检测种群样本的抗性等位基因突变频率。本发明专利技术涵盖小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因A309V突变的检测方法及专用引物序列，该方法具有快速简便、准确性高的优点，可用于监测小菜蛾田间种群对阿维菌素的抗性等位基因频率和抗药性发生发展动态，为调整小菜蛾化学防治策略、制订延缓抗性发展措施提供重要依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及小菜蛾对阿维菌素祀标抗性的分子检测方法，属于生物
，专 用于小菜蛾对广谱杀虫杀瞒剂阿维菌素（由Avermectin Bla和Avermectin B化混合组 成）祀标抗性的高灵敏度、快速分子检测。 技术背景 据统计，近年来我国蔬菜种植面积接近3亿亩/年，已是世界第一大十字花科蔬菜 种植和生产国，因小菜蛾为害造成的蔬菜减产和治理费用极其高昂。小菜蛾属于鱗翅目菜 蛾科，是世界范围内一种重要的十字花科蔬菜害虫，每年造成的经济损失达40~50亿美 元。该物种寄主植物种类达40多种，由于其繁殖周期短、适应能力强、世代重叠严重及田间 混乱用药，使小菜蛾至少已对92种杀虫活性成份产生了不同程度的抗性，几乎涉及目前所 有的防治用药，其中包括多种新型药剂如阿维菌素。小菜蛾抗药性进化问题给十字花科蔬 菜的产量和质量带来严重威胁和巨大挑战，科学有效的防治小菜蛾已成为植保工作者的肩 头重任，开发快速准确的杀虫剂抗性检测技术迫在眉睫。 阿维菌素（Avermectin)是日本北里研究所于1975年从±壤中分离的阿维链霉菌 (Str巧tomyces avermitilis)发酵液中分离出来得到的一种大环内醋化合物，1981年由美 国默克公司商品化作为兽药投放市场并获得良好业绩。阿维菌素于20世纪90年代初进入 我国并很快实现了自主生产，该药剂杀虫谱广，具有杀虫杀瞒杀线虫活性，能有效防治鱗翅 目、蜡瞒目、半翅目W及线虫等农林害虫，曾在害虫种群控制方面发挥了积极作用。但是，随 着使用量的增加和使用年限的延长，昆虫自身也对阿维菌素逐渐演化出抗药性，在我国多 个省份呈现逐年加重的趋势。谷氨酸配体口控氯离子通道（GluCl)是阿维菌素的主要作用 革己标，在线虫化enorh油ditiselegans中研究比较广泛而深入，果觸DmGluCla亚基的第二 跨膜区存在P299S点突变，通过外源表达证实该氨基酸替换导致果觸对球抱子酸、伊维菌 素和谷氨酸的敏感性降低了 10倍，为球抱子酸和伊维菌素作用于DmGluCl通道提供了直接 证据化ane等，2000)。在抗阿维菌素的二斑叶瞒Tetranychusudicae品系中研究人员发 现化GluCl存在G323D点突变，送一点突变在回交后代的个体中证实与阿维菌素抗性相关 (Kwon等,2010)。Dermauw等（2012)通过对二斑叶瞒的基因组测序，注释了多个cysLGIC 家族的基因，并进一步利用遗传学方法对GluCl的序列进行分析，发现化GluCll(G314D)和 TuGluC13 (G326巧中存在阿维菌素抗性突变位点，认为化GluCll和化GluC13是阿维菌素对 二斑叶瞒的主要作用祀点。 目前，世界多地区的田间小菜蛾已对阿维菌素产生了严重的抗药性，但国内外尚 未建立小菜蛾谷氨酸配体口控氯离子通道（PxGIuCI)突变导致的祀标抗性的分子检测方 法，基于该祀标基因的抗性检测技术局限于英光定量PCR检测方法（专利号CN102154468B， 下简称对比文件）。〔化021544688根据梁延坡在2009提交的01此1(1亚基基因序列 (GQ221939.1)设计了一序列GluCl a亚基基因的特异性引物，并根据特异性引物对小菜 蛾抗性与GluCl a亚基基因表达量之间的关系进行研究，发现GluCl a亚基基因表达量与 小菜蛾对阿维菌素的抗性呈正相关。根据送一结果，将选得的一对特异性引物F16结合英 光实时定量PCR技术及统计学方法提供一种鉴定小菜蛾抗性种群的方法；测定小菜蛾的 GluCl a亚基基因表达量，并与与阴性对照的基因表达量比较是否具有显著差异，有显著差 异说明待测小菜蛾为抗性种群。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中小菜蛾对阿维菌素抗性检测方法灵敏度低、周期 长、材料要求高等问题，根据我们对小菜蛾阿维菌素抗药性分子机理的研究结果，建立小菜 蛾对阿维菌素抗性祀标突变的快速、准确的分子检测方法。 本专利技术的目的可通过W下技术方案实现： 根据我们克隆的小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因序列（GenBank登录号 JX014231. 1)设计的特异性引物，W单头小菜蛾的基因组DNA为模板，进行谷氨酸氯离子通 道基因 TM2和TM3区域的PCR扩增，通过对目标片段纯化产物直接测序色谱图的分析，可W 区分小菜蛾个体的基因型（敏感纯合子SS、抗性杂合子RS和抗性纯合子RR)，检测种群样 本的抗性等位基因频率。本专利技术涉及小菜蛾谷氨酸氯离子通道A309V抗性点突变的检测方 法和专用引物序列。 -种小菜蛾对阿维菌素祀标抗性的分子检测方法，用SEQ ID NO. 1所示的特异性 正向引物PxGlua-Seq-F和沈Q ID NO. 2所示的特异性反向引物PxGlua-Seq-R对谷氨酸 氯离子通道基因 PxGIuCI进行PCR扩增，对PCR纯化产物直接测序，根据直接测序色谱图鉴 定小菜蛾个体PxGIuCI基因在309位氨基酸是否突变及其具体类型，一次性区分该个体为 对阿维菌素的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。 本专利技术涉及的小菜蛾野生型谷氨酸氯离子通道基因因 PxGluClcDNA序列全长 2074bp(GenBank登录号为JX014231. 1)，我们研究发现；阿维菌素敏感型基因序列第926位 核巧酸由C突变为T (附图1 =Abm-R)，其编码的蛋白质由A突变为V，并发现该突变频率与 种群对阿维菌素的抗药性化Cw值）相关，即该突变导致小菜蛾对阿维菌素的高水平祀标抗 性。所述的根据直接测序色谱图准确鉴定小菜蛾个体谷氨酸氯离子通道在309位氨基酸是 否突变及其具体类型，一次性区分该位点敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的方法为： 如果识别序列巧'-CATAGACG-3')前一位碱基为C单峰色谱（附图2.A)，则表明该小菜 蛾个体为不携带谷氨酸氯离子通道突变的敏感纯合子；如果识别序列前一位碱基为T/C双 峰色谱（附图2. B)，则表明该小菜蛾个体为携带309位氨基酸突变的杂合子；如果识别序 列前一位碱基为T单峰色谱（附图2. C)，则表明该小菜蛾个体为携带309位氨基酸突变的 纯合子。 所述的分子检测方法，优选包含如下H个步骤： (1)提取小菜蛾单头幼虫或成虫样本的基因组DNA ;[001引 似利用沈Q ID NO. 1所示的引物PxGlua-Seq-F和沈Q ID NO. 2所示的引物 PxGluCn-Seq-R，对上一步提取的小菜蛾基因组DNA进行PCR扩增； (3)将上一步获得的PCR产物进行1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，对目的片段纯化回收 后进行直接测序，测序引物为SEQ ID NO. 2所示的引物R，通过检测编码PxGIuCI基因309 位氨基酸的核巧酸测序色谱图，一次性区分在该位点为敏感纯合、抗性杂合和抗性纯合基 因型的个体。 其中，PCR 反应体系优选 50ul ;10ul SXPrimeSTAR Buffer，4ul 2. 5mM dNTPs, IOmM的正、反向引物各lul，Iul单头小菜蛾样本的基因组DM, I. 2抓PrimeSTAR服DNA聚 合酶，加双蒸水至反应总体积为50ul。PCR反应程序优选；98°C变性10砂；52°C退火15砂； 7本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小菜蛾对阿维菌素靶标抗性的分子检测方法，其特征在于用SEQ ID NO.1所示的特异性正向引物PxGluCl‑Seq‑F和SEQ ID NO.2所示的特异性反向引物PxGluCl‑Seq‑R对谷氨酸氯离子通道基因PxGluCl进行PCR扩增，对PCR纯化产物直接测序，根据直接测序色谱图鉴定小菜蛾个体PxGluCl基因的309位氨基酸是否存在丙氨酸A到缬氨酸V的突变及其具体类型，一次性区分该个体为对阿维菌素的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王兴亮，吴益东，杨亦桦，武淑文，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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