一种基因枪介导杂交狗牙根遗传转化的方法技术

技术编号：41315963 阅读：8 留言：0更新日期：2024-05-13 14:57

本发明专利技术公开了一种基因枪介导杂交狗牙根遗传转化的方法。本发明专利技术以杂交狗牙根的匍匐茎为外植体，消毒灭菌后进行愈伤组织的诱导，通过诱导愈伤成熟，筛选出黄色松脆型胚性愈伤组织为受体。按基因枪介导的遗传转化方法利用含有目的基因的轰击所得的胚性愈伤组织，依次进行预培养、轰击转化、恢复培养、筛选培养、分化培养及幼苗移栽，依次完成杂交狗牙根的遗传转化。经GUS染色和PCR验证，利用本发明专利技术的方法可成功实现将目的基因转入杂交狗牙根，3天时瞬时转化效率最高可达87.5％，阳性植株的遗传转化率为7.5％。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物遗传转化，尤其涉及一种基因枪介导杂交狗牙根遗传转化方法。

技术介绍

1、杂交狗牙根(cynodondactylon×c.transvaalensis)具有低矮致密，质地细腻等优点，是应用最广泛的暖季型草坪草之一。在自然环境中，草坪草经常受到包括干旱、盐胁迫、高温、低温等非生物的胁迫的不良影响，培育抗逆性强的草坪草种有重要意义。杂交狗牙根遗传背景复杂，且由于倍性不能产生种子，只能采用无性繁殖，给传统杂交育种带来严重限制。因此，利用基因工程对现有品种进行改良尤为重要。但由于基因型的限制，且不同品种的杂交狗牙根体细胞胚诱导不一致，愈伤的再生率和转化率低，使得杂交狗牙根的基因功能研究和品种改良较为困难。因此，建立起有效的杂交狗牙根遗传转化体系具有重要意义。

2、遗传基因枪转化法又叫粒子轰击法，是一种直接递送方法。应用基因枪介导的遗传转化方法已在多种草坪草中获得了成功。该方法通过机械过程可将外源基因直接递送至活体细胞内，其有操作简洁，受体选择较为宽泛等优点，相较于农杆菌介导的遗传转化，不仅避免了农杆菌的污染，还不受植物基因型的限制。但不同植物材料中，轰击条件对基因枪的转化效率具有显著的影响，因此，通过在杂交狗牙根中优化轰击条件，建立有效的遗传转化体系，可为杂交狗牙根基因功能研究、基因编辑等生物工程提供技术支撑。

技术实现思路

1、专利技术目的：为了解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种基因枪介导杂交狗牙根遗传转化的方法，成功建立了杂交狗牙根转化体系。

<p>2、技术方案：为了实现上述目的，本专利技术的提供一种基因枪介导杂交狗牙根遗传转化的方法，包括如下步骤：

3、(1)采用基因枪介导法将含有目的基因的载体轰击至杂交狗牙根胚性愈伤组织中，得到枪击后胚性愈伤组织；

4、(2)将步骤(1)枪击后幼胚接种至继代培养基中进行恢复培养，得到恢复生长的胚性愈伤组织；

5、(3)将步骤(2)愈伤组织接种至筛选培养基中进行培养，得到抗性愈伤组织；

6、(4)将步骤(3)抗性愈伤接种至分化培养基中进行培养，得到幼苗；

7、(5)将步骤(4)幼苗在基质中培养，得到杂交狗牙根转基因植株；

8、进一步地，所述步骤(1)中轰击参数为真空度为25-28in.hg，射击距离为6.0-9.0cm，轰击次数为1-2次。

9、进一步地，所述步骤(1)中杂交狗牙根在轰击前还包括在高渗培养基中进行预培养。

10、进一步地，所述高渗培养基为为向ms培养基中添加0.5-4.0mg/l2,4-d、0.1-1.0mg/lnaa、0.1-0.5mg/l6-ba、1.0-5.0mg/lagno3、30.0-35.0g/l蔗糖、30-35.0g/l甘露醇和8.0-10.0g/l琼脂，ph为5.6-6.0。

11、进一步地，所述步骤(2)中继代培养基为为向ms培养基中添加0.5-4.0mg/l2,4-d、0.1-0.5mg/lnaa、0.1-0.5mg/l6-ba、1.0-5.0mg/lagno3、30.0-35.0g/l蔗糖和20-25g/l琼脂，ph为5.6-6.0。

12、进一步地，所述高渗培养基和继代培养基中添加浓度为100-150μmol/l的tnx。

13、进一步地，所述步骤(3)中筛选培养基为向ms培养基中添加2,4-d、naa、6-ba、agno3、蔗糖、琼脂、潮霉素b，其中,2,4-d、naa、6-ba、agno3、蔗糖、琼脂、潮霉素b的添加量分别为0.5-4.0mg/l、0.1-0.5mg/l、0.1-0.5mg/l、1.0-5.0mg/l、30.0mg/l、7.0-8.0g/l、150.0-200.0mg/l，ph为5.6-6.0。

14、进一步地，所述步骤(4)分化培养基为向ms培养基中添加0.5-2.0mg/l6-ba、0.1-0.5mg/lnaa、30.0g/l蔗糖、7.0-8.0g/l琼脂、150.0-200.0mg/l潮霉素b，ph为5.6-6.0。

15、进一步地，所述步骤(2)继代培养的条件为25-30℃黑暗环境培养7-9d。

16、作为优选，所述步骤(2)继代培养的条件为25℃黑暗环境培养7d。

17、进一步地，所述步骤(3)筛选培养基的条件为25-30℃黑暗环境培养60-65d，期间每20-25d更换一次筛选培养基，所述步骤(4)中分化培养条件为在25-30℃下光周期16.0-18.0h培养。

18、作为优选，所述步骤(3)筛选培养基的条件为25℃黑暗环境培养60d，期间每20d更换一次筛选培养基，所述步骤(4)中分化培养条件为在25℃下光周期16.0h培养。

19、有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下显著优点：

20、本专利技术首先优化了再生体系，选择以匍匐茎为外植体，具有遗传背景一致，不受季节限制，取材广泛等优点。在愈伤诱导环节，设计正交试验，设置不同激素浓度，筛选出最适愈伤诱导配方，其次通过调整渗透压，促进杂交狗牙根胚性愈伤的成熟并具备较高的再生系数。在杂交狗牙根转化过程中，选择以基因枪介导的转化方式，具有不受基因型限制，避免农杆菌污染等优点。

21、本专利技术优化激素浓度及培养方式，建立了高频的杂交狗牙根再生体系，植株再生系数为5.8，高于chaudhury和goldman等在tifway和tifeagle品种上所报道的效率(chaudhury,a.andr.qu.2000.somaticembryogenesisandplantregenerationofturftypebermudagrass:effectof6-benzyladenineincallusinductionmedium.plantcell,tissue,and organculture60:113-120.goldman,j.j.,w.w.hanna,andp.ozias-akins.2002.tissue cultureandtransformationoftifsportandtifeaglehybridbermudagrass.in:annual meetingsabstracts,americansocietyofagronomy,madison,wi.)。通过基因枪介导，实现杂交狗牙根的转化，3天时瞬时转化效率最高可达87.5％，阳性植株的遗传转化率为7.5％。

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【技术保护点】

1.一种基因枪介导杂交狗牙根遗传转化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述遗传转化的方法，其特征在于，所述步骤(1)中轰击参数为真空度为25-28in.Hg，射击距离为6.0-9.0cm，轰击次数为1-2次。

3.根据权利要求1所述遗传转化的方法，其特征在于，所述步骤(1)中杂交狗牙根在轰击前还包括在高渗培养基中进行预培养。

4.根据权利要求3所述遗传转化的方法，其特征在于，所述高渗培养基为向MS培养基中添加0.5-4.0mg/L 2,4-D、0.1-0.5mg/LNAA、0.1-1.0mg/L 6-BA、1.0-5.0mg/LAgNO3、30.0-35.0g/L蔗糖、30-35.0g/L甘露醇和7.0-8.0g/L琼脂，pH为5.6-6.0。

5.根据权利要求1所述遗传转化的方法，其特征在于，所述步骤(2)中继代培养基为向MS培养基中添加0.5-4.0mg/L 2,4-D、0.1-0.5mg/LNAA、0.1-0.5mg/L 6-BA、1.0-5.0mg/LAgNO3、30.0-35.0g/L蔗糖和7.0-8.0g/L琼脂，PH为5.6-6.0。

6.根据权利要求1所述遗传转化的方法，其特征在于，所述高渗培养基和继代培养基中还需添加浓度为100-150μmol/L的TNX。

7.根据权利要求1所述遗传转化的方法，其特征在于，所述步骤(3)中筛选培养基为向MS培养基中添加2,4-D、NAA、6-BA、AgNO3、蔗糖、琼脂、潮霉素B，其中,2,4-D、NAA、6-BA、AgNO3、蔗糖、琼脂、潮霉素B的添加量分别为0.5-4.0mg/L、0.1-0.5mg/L、0.1-0.5mg/L、1.0-5.0mg/L、30.0mg/L、7.0-8.0g/L、150.0-200.0mg/L，PH为5.6-6.0。

8.根据权利要求1所述遗传转化的方法，其特征在于，所述步骤(4)分化培养基B为向MS培养基中添加0.5-2.0mg/L 6-BA、0.1-0.5mg/LNAA、30.0g/L蔗糖、7.0-8.0g/L琼脂、150.0-200.0mg/L潮霉素B，PH为5.6-6.0。

9.根据权利要求1所述遗传转化的方法，其特征在于，所述步骤(2)继代培养的条件为25-30℃黑暗环境培养7-9d。

10.根据权利要求1所述遗传转化的方法，其特征在于，所述步骤(3)筛选培养基的条件为25-30℃黑暗环境培养60-65d，期间每20-25d更换一次筛选培养基，所述步骤(4)中分化培养条件为在25-30℃下光周期16.0-18.0h培养。

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【技术特征摘要】

1.一种基因枪介导杂交狗牙根遗传转化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述遗传转化的方法，其特征在于，所述步骤(1)中轰击参数为真空度为25-28in.hg，射击距离为6.0-9.0cm，轰击次数为1-2次。

3.根据权利要求1所述遗传转化的方法，其特征在于，所述步骤(1)中杂交狗牙根在轰击前还包括在高渗培养基中进行预培养。

4.根据权利要求3所述遗传转化的方法，其特征在于，所述高渗培养基为向ms培养基中添加0.5-4.0mg/l 2,4-d、0.1-0.5mg/lnaa、0.1-1.0mg/l 6-ba、1.0-5.0mg/lagno3、30.0-35.0g/l蔗糖、30-35.0g/l甘露醇和7.0-8.0g/l琼脂，ph为5.6-6.0。

5.根据权利要求1所述遗传转化的方法，其特征在于，所述步骤(2)中继代培养基为向ms培养基中添加0.5-4.0mg/l 2,4-d、0.1-0.5mg/lnaa、0.1-0.5mg/l 6-ba、1.0-5.0mg/lagno3、30.0-35.0g/l蔗糖和7.0-8.0g/l琼脂，ph为5.6-6.0。

6.根据权利要求1所述遗传转化的方法，其特征在于，所述高渗培养基和继代培养基中还需添加浓度为10...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨志民，韩鹏，于景金，何法慧，刘君，陈煜，庄黎丽，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：

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