用于检测EGFRT790M基因的引物探针组合和一种改进的PCR方法技术

本发明专利技术公开了用于检测EGFR T790M基因的引物探针组合和一种改进的PCR方法。所述组合包含了独特的引物、探针和抑制剂。本发明专利技术还公开了独特的PCR反应，通过调整引物浓度、寻找关键的显著影响对野生模板扩增的最高变性温度Tm1和不显著影响对突变模板进行扩增的最低变性温度Tm2，建立qPCR的反应条件，实现了灵敏度高，特异性强，稳定性好、高准确度和高精密度的检测效果，而且具有周期短、成本低特点。本发明专利技术的定量检测灵敏度可以达到0.0025％，可用于定量检测0.0025％的低拷贝突变模板；定性检测灵敏度可以达到0.0005％，可用于定性检测低至0.0005％的低拷贝突变模板；现有的技术方法，包括在qPCR和ddPCR平台上建立方法，它们的灵敏度大都没有超过0.01％。敏度大都没有超过0.01％。敏度大都没有超过0.01％。

【技术实现步骤摘要】
用于检测EGFR T790M基因的引物探针组合和一种改进的PCR方法


[0001]本专利技术属于基因检测的
，具体涉及用于检测EGFR T790M基因的引物探针组合和一种改进的PCR方法。

技术介绍

[0002]在1948年，Mandel和Metais发现血浆中存在游离的核酸分子，即cfDNA(cell free DNA)。cfDNA是通过细胞凋亡、坏死和分泌释放到血液中，cfDNA通常是双链片段，长度约为150
‑
200个碱基对。ctDNA(Circulating tumor DNA)是cfDNA的一部分。ctDNA的主要来源包括：坏死的肿瘤细胞、凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、肿瘤细胞分泌的外排体。
[0003]健康成年人的cfDNA浓度一般很低，通常不到每毫升血浆10微克。1977年，Leon等人发现，肿瘤患者的cfDNA水平要明显高于健康人群。ctDNA在cfDNA中的比例波动范围较大(<0.01％～10％)，受肿瘤分期、转移等影响。
[0004]血液中ctDNA的提取具有无创性和易获得性。在其中发现的肿瘤标志物，被认为可以用于肿瘤诊断的各个过程。包括但不限于早期评估罹患肿瘤的风险，实时评估患者的病情进展，监控患者对治疗方式的反应，评估基因突变率、判断预后等。目前已经有很多共识和指南推荐对ctDNA进行检测，FDA和欧洲肿瘤内科学会ESMO也对ctDNA的检测提出建议。
[0005]目前对于ctDNA的检测实验，需要解决的主要问题是如何从高丰度的野生序列干扰条件下，检测到较低浓度的突变序列。因此高灵敏度和高特异性的实验方法是十分有必要的。目前主要的检测ctDNA的技术主要包括PCR和NGS法，对于未知突变基因，需要通过NGS高通量测序的方法进行检测，但是其成本较高，灵敏度低；而对于已知突变位点的序列，可以通过PCR方法进行检测，这种方法具有检测时间短、灵敏度高等特点。其中PCR方法还包括qPCR和ddPCR，两种方法都具有较高的灵敏度，目前市场上已经存在PCR方法检测ctDNA的试剂盒，其灵敏度可以达到0.1％(即平均每1000分子野生模板中能检测到1分子的突变模板)。但是由于突变基因的比例会低至0.01％，所以ESMO也建议开发超灵敏度(<0.01％)的检测方法。
[0006]表皮生长因子受体(EGFR)是一类重要的跨膜受体，它们在细胞生理过程中调控着细胞的增殖和凋亡等重要功能。EGFR突变是非小细胞肺癌(NSCLC)最常见的驱动基因突变。其中EGFR T790M突变是导致酪氨酸激酶抑制剂治疗过程中出现获得性耐药性的主要因素，因此EGFR T790M突变的检测对于一线用药的疗效监控有着重要意义。
[0007]目前，针对EGFR基因突变的检测方法主要有直接测序法、传统的荧光定量PCR法和高分辨率熔解曲线法。测序法耗时长且灵敏度低，通常只用于科研，难以用于临床的检测。传统的荧光定量PCR法难以使突变型基因在大量的野生型基因中得到专一性的扩增，容易产生假阳性的检测结果。高分辨率熔解曲线法所使用的仪器较特殊，难以在医院进行普及，而且此方法在检测缺失突变时，效果较差。若能在癌症早期检测出癌基因，早发现早治疗，另外，快速准确灵敏地检测这些与药物反应性有关的基因突变，可以大大提高癌症患者的
存活率。但由于癌症早期癌变样品特别是血液样品中的癌基因含量很少，而以上方法的检测灵敏度最多只能达到0.2％，远远还没达到从大量正常DNA背景下检测极其微量的异常DNA分子的要求，因此，快速准确灵敏地检测这些与药物反应性有关的EGFR基因突变，就成为人们亟待解决的问题。
[0008]基于以上研究背景，我们开发了一种具有高灵敏度检测EGFR T790M的方法。本专利技术的方法基于低温变性共扩增PCR技术(COLD
‑
PCR)，由于每条DNA序列都有低于其熔点的临界变性温度(T)，一旦低于这个温度时PCR的效率将急剧下降。当PCR变性温度设定在临界点时，由于单个碱基的不同，重复循环扩增时，导致不同的DNA有不同效率的扩增产物，因此COLD
‑
PCR尤其可用于扩增丰度较低的突变型基因，但确定合适的临界变性温度存在较大困难。

技术实现思路

[0009]对于ctDNA而言，突变基因的比例会低至0.01％，目前大部分检测方法的灵敏度都不超过0.1％。本专利技术的目的是提供一种高灵敏度的(<0.01％)、简便的检测ctDNA的方法。本专利技术具体的技术方案包括：
[0010]本专利技术第一方面提供了一种探针，该探针的序列为Seq
‑
probe(CCCTTCGGCTGCCTCCTGGA)，所述探针具有荧光基团和淬灭基团。
[0011]本专利技术第二方面提供了一种引物对，所述引物对包含一种选自Seq
‑
F1至Seq
‑
F8的上游引物,和一种通用下游引物，所述上游引物的序列为：
[0012]序列名称序列组成Seq
‑
F1TCACCTCCACCGTGCAGCTCATCTTSeq
‑
F2TCACCTCCACCGTGCAGCTCATCCTSeq
‑
F3TCACCTCCACCGTGCAGCTCATGATSeq
‑
F4TCACCTCCACCGTGCAGCTCATTATSeq
‑
F5GCGTCACCTCCACCGTGCAGAAACTCATCTTSeq
‑
F6GCGTCACCTCCACCGTGCAGAAACTCATGATSeq
‑
F7TCACCTCCACCGTGCAGATCGTGCTCATCTTSeq
‑
F8TCACCTCCACCGTGCAGATCGTGCTCATGAT。
[0013]在本专利技术的具体实施方式中，所述下游引物的序列为Seq
‑
R(ACACCAGTTGAGCAGGTACTGGGAG)。
[0014]本专利技术第三方面还提供了一种抑制剂，所述抑制剂序列为Seq
‑
Bloker1(CGTGCAGCTCATCACGCAGCTCAT)和/或Seq
‑
Bloker2(CGTGCAGCTCATCTCGCAGCTCAT)，所述抑制剂具有淬灭基团修饰。
[0015]本专利技术第四方面还提供了一种组合物、试剂盒或试剂组合，其特征在于：包括上述探针，引物对和抑制剂。
[0016]在本专利技术的具体实施方式中，所述组合物、试剂盒或试剂组合包括：如下序列的引物对、探针和抑制剂：
[0017]序列名称序列组成
Seq
‑
F2TCACCTCCACCGTGCAGCTCATCCTSeq
‑
RACACCAGTTGAGCAGGTACTGGGAGSeq
‑
ProbeCCCTTCGGCTGCCTCCTGGASeq
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种探针，其特征在于：该探针的序列为Seq
‑
ProbeCCCTTCGGCTGCCTCCTGGA，所述探针具有荧光基团和淬灭基团。2.一种引物对，所述引物对包含一种选自Seq
‑
F1至Seq
‑
F8的上游引物,和一种通用下游引物，所述上游引物的序列为：序列名称序列组成Seq
‑
F1TCACCTCCACCGTGCAGCTCATCTTSeq
‑
F2TCACCTCCACCGTGCAGCTCATCCTSeq
‑
F3TCACCTCCACCGTGCAGCTCATGATSeq
‑
F4TCACCTCCACCGTGCAGCTCATTATSeq
‑
F5GCGTCACCTCCACCGTGCAGAAACTCATCTTSeq
‑
F6GCGTCACCTCCACCGTGCAGAAACTCATGATSeq
‑
F7TCACCTCCACCGTGCAGATCGTGCTCATCTTSeq
‑
F8TCACCTCCACCGTGCAGATCGTGCTCATGAT。3.根据权利要求2所述的引物对，所述下游引物的序列为Seq
‑
RACACCAGTTGAGCAGGTACTGGGAG。4.一种抑制剂，所述抑制剂序列为Seq
‑
Bloker1CGTGCAGCTCATCACGCAGCTCAT和/或Seq
‑
Bloker2 CGTGCAGCTCATCTCGCAGCTCAT，所述抑制剂具有淬灭基团修饰。5.一种组合物、试剂盒或试剂组合，其特征在于：包括权利要求1所述探针，权利要求2
‑
3任一所述引物对和权利要求4所述抑制剂。6.根据权利要求5所述的组合物、试剂盒或试剂组合，所述引物对、探针和抑制剂为如下序列：序列名称序列组成Seq
‑
F2TCACCTCCACCGTGCAGCTCATCCTSeq
‑
RACACCAGTTGAGCAGGTACTGGGAGSeq
‑
ProbeCCCTTCGGCTGCCTCCTGGASeq
‑
Bloker1CGTGCAGCTCATCACGCAGCTCAT优选地，Seq
‑
Probe的5
’
端和3
’
端具有荧光基团和淬灭基团，进一步优选地，结构为FAM
‑
CCCTTCGGCTGCCTCCTGGA
‑
MGB；优选地，Seq
‑
Bloker1 3
’
端为封闭碱基；进一步优先地为淬灭基团封闭，例如：CGTGCAGCTCATCACGCAGCTCAT
‑
MGB。7.根据权利要求5或6所述的组合物、试剂盒或试剂组合，所述引物对的上游引物反应浓度高于下游引物。8.根据权利要求5
‑
7任一项所述的组合物、试剂盒或试剂组合，所述引物、探针和抑制剂的种类和反应浓度如下：序列名称反应浓度Seq
‑
F2500nMSeq
‑
R250nM
Seq
‑
Probe250nMSeq
‑
Bloker1500nM。9.权利要求5
‑
8任一所述组合物、试剂盒或试剂组合在制备EGFR T790M突变检测试剂中的应用。10.权利要求5
‑
8任所述组合物、试剂盒或试剂组合在检测EGFR T790M突变的应用，所述应用为非诊断目的。11.一种对EGFR T790M突变进行扩增的方法，所述方法包括第一循环阶段和第二循环阶段，其特征在于第一循环阶段的变性温度Tm1和第二循环阶段的变性温度Tm2不同，并且皆低于95℃。12.根据权利要求11所述的方法，所述第一循环阶段的变性温度Tm1为82℃
±
1℃，所述第二循环阶段的变性温度Tm2为80.5℃
±
1℃。13.根据权利要求11所述的方法，所述方法使用包含选自Seq
‑
F1至Seq
‑
F8的上游引物和一种通用下游引物Seq
‑
R的引物对实现扩增：R的引物对实现扩增：。14.根据权利要求11
‑
13任一项所述的方法，所述方法使用抑制剂，所述抑制剂序列为S...

【专利技术属性】
技术研发人员：苑胜垒，贾楠，王丹，刁建波，张辰浦，李兰，
申请(专利权)人：上海药明康德新药开发有限公司，
类型：发明
国别省市：