PIK3CA H1047R敲入非人动物乳腺癌模型制造技术

本发明专利技术涉及PIK3CA H1047R敲入非人动物乳腺癌模型的开发，及其用于鉴定涉及纺锤细胞肿瘤形成的自发性功能丧失性TP53突变的用途。本发明专利技术还涉及使用这种模型对乳腺肿瘤中别的体细胞突变和拷贝数异常的鉴定，及用于诊断和治疗乳腺癌的方法和手段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】PIK3CAH1047R敲入非人动物乳腺癌模型专利
本专利技术涉及PIK3CAH1047R敲入非人动物乳腺癌模型的开发，及其用于鉴定涉及纺锤细胞肿瘤形成的自发性功能丧失性TP53突变的用途。本专利技术还涉及使用这种模型对乳腺肿瘤中别的体细胞突变和拷贝数异常的鉴定，及用于诊断和治疗乳腺癌的方法和手段。专利技术背景IA类PI3K催化亚基p110α，p110β和p110δ作为与p85α，p55α，p50α，p85β或p55γ调节亚基复合的专性异二聚体存在。在正常细胞中，PI3K维持于基础无活性状态且在生长因子刺激和细胞表面受体参与后变成有活性。活化的PI3K磷酸化并转化磷脂酰肌醇4,5二磷酸酯（PIP2），产生磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸酯（PIP3）。升高的细胞PIP3水平促进PI3K效应器活化，其继而调节多种细胞过程，包括细胞生长，增殖和存活（参见Cantley，L.C.，Science296，1655-7（2002）；Hawkins，P.T.etal.，BiochemSocTrans34，647-62（2006）；及Vanhaesebroeck，B.，etal.，TrendsBiochemSci30，194-204（2005））。已经在结肠直肠癌，乳腺癌和肝癌中报告了编码p110α的基因PIK3CA中的频繁体细胞突变（Samuels，Y.etal.，Science304，554（2004）；Bachman，K.E.etal.，CancerBiolTher3，772-5（2004）；Lee，J.W.etal.，Oncogene24，1477-1480（2004））。报告的p110α突变大多发生在三个热点中–螺旋域中的两个（E542K和E545K）和激酶域中的一个（H1047R）（Bader，A.G.etal.，NatRevCancer5，921-9（2005）；Zhao，L.&Vogt，P.K.，ProcNatlAcadSciUSA105，2652-7（2008））。这些热点突变产生致癌性p110α，其能够组成性激活下游信号传导（Zhao，L.&Vogt，见上文）。而且，在异种移植物模型中，该p110α突变体在细胞中表达时能导致细胞转化及支持肿瘤形成（Samuelsetal.，见上文；Zhao，L.&Vogt，Oncogene27，5486-5496（2008）；Isakoff，S.J.，CancerResearch65，10992-11000（2005）；Bader，A.G.，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences103，1475-1479（2006）；Horn，S.etal.，Oncogene27，4096-4106（2008））。人癌症的遗传工程化小鼠模型（GEMM）充当重要资源，用于了解肿瘤启动和进展（Walrath，J.C.，Hawes，J.J.，VanDyke，T.&Reilly，K.M.，Geneticallyengineeredmousemodelsincancerresearch.AdvCancerRes106，113-64（2010））。GEMM还已经用于测试治疗剂及开发治疗策略（Singh，M.etal.，AssessingtherapeuticresponsesinKrasmutantcancersusinggeneticallyengineeredmousemodels.NatBiotechnol28，585-93（2010））。致力于了解突变型PIK3CA所致致癌性转化的研究主要使用基于细胞的系统，异种移植物模型和转基因模型（Samuelsetal.，见上文；Isakoff，见上文；Bader，A.G.，见上文；Horn，S.etal.，见上文；Engelman，J.A.etal.，NatMed14，1351-6（2008）；Adams，J.R.etal.，CancerResearch71，2706-2717（2011）；Meyer，D.S.etal.，CancerResearch（2011））。鉴于PIK3CA突变的较高频率和一直以来开发小分子抑制剂的努力，能自其天然启动子和基因组架构表达内源水平的突变型PIK3CA敲入小鼠模型将会是研究肿瘤启动，进展和治疗的有价值工具。还有，此类模型自身将会适于鉴定在肿瘤发生期间与突变型PIK3CA合作的损伤。想着这一点，我们制备了遗传工程化小鼠模型，其中通过放置一休眠拷贝编码H1047R的致癌性突变型PIK3CA外显子20，与编码外显子20的野生型相邻，我们修饰了内源PIK3CA等位基因。在激活休眠突变型等位基因之前，工程化小鼠表达经修饰野生型PIK3CA（PIK3CAe20mwt）。然而，在Cre介导的重组之后，突变型PIK3CAH1047R等位基因PIK3CAe20H1047R被激活，导致其表达。我们显示了PIK3CAH1047R等位基因在小鼠乳腺上皮中的条件性激活导致突变型PIK3CAH1047R表达和肿瘤发生。虽然下一代测序能够随着人肿瘤发生和发展进行人肿瘤的碱基对水平表征（Shah，S.P.etal.，Nature461，809-813（2009）；Ding，L.etal.，Nature464，999-1005（2010）），癌症的小鼠模型提供确定的实验易处理系统，其容许随着肿瘤发生进行系统性采样和肿瘤表征。在序列水平表征肿瘤的一项努力中，我们实施了肿瘤全外显子组捕捉和测序，并鉴定出自发性功能丧失性TP53突变的出现，其作为涉及纺锤细胞肿瘤形成的潜在合作事件。本专利技术还涉及来自这种模型的乳腺肿瘤中别的体细胞突变和拷贝数异常的鉴定。在分子表征之外，还对PI3K小分子抑制剂的能力测试了功效，而且结果显示肿瘤响应抑制剂治疗。专利技术概述一方面，本专利技术涉及一种非人转基因动物，其包含经修饰内源PIK3CA基因座，其中所述经修饰内源PIK3CA基因座包含与野生型外显子20相邻的编码H1047R的休眠突变型PIK3CA外显子20，且其中所述非人转基因动物能够进行PIK3CAH1047R（PIK3CAe20H1047R）突变型等位基因的条件性表达。在一个实施方案中，所述突变型等位基因处于PIK3CA内源启动子控制之下。在另一个实施方案中，条件性表达是由突变型等位基因通过Cre介导的重组的激活触发的。在还有另一个实施方案中，条件性激活是组织特异性的。在又一个实施方案中，条件性激活导致突变型PIK3CAH1047R表达和肿瘤发生。在所有实施方案中，所述非人转基因动物可以是例如啮齿类动物，诸如小鼠或大鼠。另一方面，本专利技术涉及一种荷瘤非人转基因动物，其条件性表达PIK3CAH1047R（PIK3CAe20H1047R）突变型等位基因处于PIK3CA内源启动子控制之下。在一个实施方案中，所述动物以组织特异性方式表达PIK3CAH1047R突变型等位基因。在另一个实施方案中，所述PIK3CAH1047R突变型等位基因在所述动物的乳腺中表达且所述肿瘤是乳腺肿瘤。在还有另一个实施方案中，所述荷瘤非人转基因动物对于PIK3CAH1047R突变型等位基因是杂合的。在另一个实施方案中，所述荷本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非人转基因动物，其包含经修饰内源PIK3CA基因座，其中所述经修饰内源PIK3CA基因座包含与野生型外显子20相邻的编码H1047R的休眠突变型PIK3CA外显子20，且其中所述非人转基因动物能够进行PIK3CA H1047R（PIK3CAe20H1047R）突变型等位基因的条件性表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.07.28 US 61/574,1611.一种转基因小鼠细胞或组织，其包含经修饰内源PIK3CA基因座，其中所述经修饰内源PIK3CA基因座包含与野生型外显子20相邻的编码H1047R的休眠突变型PIK3CA外显子20，且其中所述转基因小鼠能够在乳腺中进行PIK3CAH1047R(PIK3CAe20H1047R)突变型等位基因的组织特异性条件性表达，其中所述突变型等位基因的条件性表达处于PIK3CA内源启动子控制之下，且其中所述条件性表达是由所述突变型等位基因通过Cre介导的重组的激活触发的。2.权利要求1的转基因小鼠细胞或组织，其中所述条件性表达导致突变型PIK3CAH1047R表达和肿瘤发生。3.一种转基因小鼠肿瘤细胞或组织，其条件性表达处于PIK3CA内源启动子控制之下PIK3CAH1047R(PIK3CAe20H1047R)突变型等位基因，其中所述PIK3CAH1047R突变型等位基因在所述小鼠的乳腺中表达且所述肿瘤是乳腺肿瘤。4.权利要求3的转基因小鼠肿瘤细胞或组织，其对于PIK3CAH1047R突变型等位基因是杂合的。5.权利要求3的转基因小鼠肿瘤细胞或组织，其对于PIK3CAH1047R突变型等位基因是纯合的。6.权利要求3的转基因小鼠肿瘤细胞或组织，其中所述乳腺肿瘤选自下组：纤维腺癌，腺癌和纺锤细胞瘤形成。7.一种用于生成包含经修饰内源PIK3CA基因座的转基因啮齿类动物的方法，其中所述经修饰内源PIK3CA基因座包含与野生型外显子20相邻的编码H1047R的休眠突变型PIK3CA外显子20，且其中所述转基因啮齿类动物能够进行PIK3CAH1047R(PIK3CAe20H1047R)突变型等位基因的条件性表达，所述方法包括放置一拷贝编码H1047R突变的外显子20，与编码野生型PIK3CA等位基因的外显子20相邻。8.权利要求7的方法，其中所述编码野生型PIK3CA等位基因的外显子20侧翼为loxP位点，接着是转录终止盒和一拷贝编码H1047R突变的PIK3CA外显子20。9.一种筛选用于治疗肿瘤的药物候选物的方法，其包括(a)将药物候选物施用于条件性表达处于PIK3CA内源启动子控制之下PIK3CAH1047R(PIK3CAe20H1047R)突变型等位基因的荷瘤啮齿类动物，(b)测量所述肿瘤对所述治疗的响应，并(c)对所述动物处以安乐死。10.权利要求9的方法，其中步骤(b)包括评估所述药物候选物引起至少一种选自下组的响应的能力：减少肿瘤细胞数目，缩小肿瘤尺寸或肿瘤负荷，抑制肿瘤细胞浸润入周围器官，抑制肿瘤转移，和抑制肿瘤生长。11.权利要求9的方法，其中所述肿瘤选自下组：纤维腺癌，腺癌和纺锤细胞瘤形成。12.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：S塞沙吉里，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH