本发明专利技术公开了一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法，经过人牙髓干细胞的分离与原代培养、牙髓干细胞成软骨分化鉴定、牙髓干细胞成脂分化鉴定、多孔壳聚糖支架的制备和共培养步骤完成牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备；本发明专利技术制作的壳聚糖支架，通过电镜下观测牙髓干细胞与壳聚糖之间的黏附情况，从而有效证实了牙髓干细胞与壳聚糖支架具有良好的生物相容性，同时壳聚糖支架对牙髓干细胞无毒性反应。
Method for preparing dental pulp stem cells and chitosan scaffold complex
The invention discloses a preparation method of dental pulp stem cells and chitosan scaffold, after cell isolation and primary culture of human dental pulp stem, dental pulp stem cells into cartilage differentiation and identification of dental pulp stem cells adipogenic differentiation and identification of porous chitosan scaffolds were prepared by co culture and the steps to complete dental pulp stem cells and chitosan scaffold preparation; chitosan scaffolds prepared by the invention by electron microscope observation of adhesion between dental pulp stem cells and chitosan, which confirmed that the dental pulp stem cells and chitosan scaffold has good biocompatibility, and chitosan scaffolds on cell toxicity of dental pulp stem.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种复合体的制备方法，具体涉及一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法。
技术介绍
目前用于神经组织再生工程研究较多的间充质干细胞主要为来自骨髓和脂肪组织的骨髓间充质干细胞及脂肪间充质干细胞。已研究表明，它们可以定向分化成SCs及具有形成髓鞘的能力。但这些间充质干细胞在临床上受其来源及获取方式的限制，临床应用前景有缺陷。近年来研究者从成人第三磨牙的牙髓组织中成功分离培养出一种新的间充质干细胞-牙髓干细胞，它是一种具有多向分化潜能、参与免疫调节、诱导免疫耐受、并具有组织修复能力的干细胞。关于牙髓干细胞的研究也日益增多。Daniel.L等人将来源于同一供体的牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞比较后发现，它们具有相似的细胞形态和流式细胞谱，并且都具有克隆集落形成能力及多向分化能力，然而，所不同的是牙髓干细胞较骨髓间充质干细胞相比，具有更高的增殖能力，并且在骨诱导基中显示了更高的碱性磷酸酶活性。更重要的是，从人体内提取骨髓间充质干细胞的过程是一种有创性的，并且给患者带来巨大的痛苦；而牙髓干细胞的获得相比就简单便捷，临床治疗过程中的一些丢弃的牙齿，例如埋伏阻生牙、因正畸拔出的牙齿以及不可逆性牙周炎丧失的牙齿，都可以作为干细胞库的可靠来源。同时，在生物医用领域中，壳聚糖支架是一种成熟支架，已用于生物医学研究多年。具有可以给细胞的生长提供空间，使其在支架上生长、繁殖，最终形成具有一定功能的器官的特点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种能够有效维护和促进人体细胞和组织的生长，从而恢复、维持或提高受损组织或器官的功能的牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法，其创新点在于：经过人牙髓干细胞的分离与原代培养、牙髓干细胞成软骨分化鉴定、牙髓干细胞成脂分化鉴定、多孔壳聚糖支架的制备和共培养步骤完成牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备；所述具体步骤如下：（1）人牙髓干细胞的分离与原代培养：取临床上被拔出的完整的第三磨牙，将离体牙置入碘伏中浸泡1分钟，用无菌生理盐水冲净牙齿表面血迹，用无菌咬骨钳沿釉牙骨质界打开髓腔，镊子取出牙髓，并剪除近根部牙髓组织，选用反应酶与剪碎的牙髓组织混合消化1小时，将消化后的组织置于离心机中以1000rpm/min转速，离心5分钟，弃去上清液，加入完全培养基中，吹打混匀，经70µm的细胞金属网过滤，将获得的细胞悬浮液接种于10cm培养箱中，加入完全培养液进行培养，所述培养箱培养条件为相对湿度100%，5%CO2，37℃；3天更换一次培养液，细胞融合达到70%-80%后，室温条件下，0.25%胰蛋白酶消化2分钟，1000rpm/min离心5分钟，弃除上清，吹打沉淀，混匀后以1:3比例传代，每3天换液1次，取第三代牙髓干细胞进行观察；（2）牙髓干细胞成软骨分化鉴定：取第三代牙髓干细胞制成2×105细胞/ml的细胞悬液，取1ml的步骤（1）中的细胞悬液加入到15ml离心管，在1000rpm/min转速下离心5分钟，分化组加入成软骨培养液,对照组加入完全培养液，培养4周后取材检测成软骨分化情况，取材后将标本放入4%多聚甲醛中固定24小时，20%蔗糖固定2天，30%蔗糖固定3天，组织嵌入O.T.C.化合物包埋，切成5μm厚切片，取出切片，置于烘箱内，37℃下放置30分钟，0.01MPBS液中漂洗两次，每次漂洗5分钟，甲苯胺蓝染色观察细胞外基质中糖胺多糖分泌情况；（3）牙髓干细胞成脂分化鉴定：取第三代牙髓干细胞以3,000个/cm2密度接种于6孔中，分化组加入成脂分化培养液，对照组加入完全培养液，2-3天更换一次培养基，诱导分化3周，吸弃细胞培养液，0.01MPBS冲洗5min×3次，4%多聚甲醛中固定1小时，0.01MPBS冲洗5min×3次，吸干后油红染色30min，60%乙醇分色至背景清晰，蒸馏水冲洗后显微镜下观察见串珠状圆形透明脂滴形成；（4）多孔壳聚糖支架的制备：将壳聚糖粉末溶于密度为1%的醋酸溶液中配制成密度为2%的溶液,向24孔培养板每孔中加入密度为2%壳聚糖醋酸溶液1ml置于4℃环境下，放置6h,再置于-28℃冷冻过夜后,再放入-60℃下冷冻干燥24h，向培养板每孔中加入0.1mol/L的NaOH溶液1ml碱化20min,再用pH为7.2的0.01mol/L的PBS清洗3次,最后再进行两次冷冻干燥，壳聚糖支架接种细胞前用70%的乙醇先灭菌,再用无菌的生理盐水清洗3次,最后经紫外灯照射干燥20min；（5）共培养：细胞每次接种前先从培养皿中吹打下来，加入灭菌后的壳聚糖支架，吸取含有游离干细胞的培养液，最后将载有牙髓干细胞的壳聚糖支架放入培养箱中进行培养，培养箱培养条件为相对湿度100%、5%CO2、37℃，24h后可检测细胞吸附情况及进行后续实验。进一步的，所述步骤（1）中的反应酶为4mg/ml分散酶与3mg/mlI型胶原酶的混合物，所述分散酶与I型胶原酶的混合体积比为1:1,所述反应酶与剪碎的牙髓组织的混合体积为1:10。进一步的，所述完全培养液为在DMEM基础培养基中加入10%胎牛血清、1%谷氨酸、1%青霉素或链霉素。进一步的，所述步骤（2）中的成软骨培养液为DMEM基础培养基中加入10µg/mlITS-X,10ng/mlTGF-β3，1.0µg/ml地塞米松、5.35µg/ml亚油酸、10%胎牛血清、1%谷氨酸、1%青霉素或链霉素。进一步的，所述步骤（3）中的成脂分化培养液为1.0µg/ml地塞米松、5µg/ml胰岛素、0.5mmol/lIBMX和60µmol/l吲哚美辛。本专利技术的有益效果如下：（1）本专利技术选用的牙髓干细胞具有多向分化能力，可向成骨细胞、成牙本质细胞、成脂肪细胞和成神经细胞分化，为进一步的应用提供了有力的支持。（2）本专利技术制作的壳聚糖支架，通过电镜下观测牙髓干细胞与壳聚糖之间的黏附情况，从而有效证实了牙髓干细胞与壳聚糖支架具有良好的生物相容性，同时壳聚糖支架对牙髓干细胞无毒性反应。附图说明图1为本专利技术的牙髓干细胞外观图；图2为本专利技术的牙髓干细胞成软骨分化4周鉴定图；图3为本专利技术的牙髓干细胞成脂肪分化3周鉴定图；图4为本专利技术的扫描电子显微镜观察到壳聚糖支架的形态结构图；图5为本专利技术的牙髓干细胞粘附于壳聚糖支架上的形态结构图；图6为本专利技术的与壳聚糖共培养过的牙髓干细胞的形态结构图；图7为本专利技术的与壳聚糖共培养过的牙髓干细胞阴性对照图的形态结构图；图8为本专利技术的与酒精共培养过的牙髓干细胞的形态结构图；图9为本专利技术的壳聚糖支架的细胞毒性分析图；图10为本专利技术的牙髓干细胞改善的脊髓损伤大鼠的生存曲线；图11为本专利技术的牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体用于损伤大鼠恢复图；图12为本专利技术的牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体8周后分别分析各组轴突计数图；图13为本专利技术的牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体8周后分别分析各组动作电位图。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效。一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法，经过人牙髓干细胞的分离与原代培养、牙髓干细胞成软本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法，其特征在于：经过人牙髓干细胞的分离与原代培养、牙髓干细胞成软骨分化鉴定、牙髓干细胞成脂分化鉴定、多孔壳聚糖支架的制备和共培养步骤完成牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备；所述具体步骤如下：（1）人牙髓干细胞的分离与原代培养：取临床上被拔出的完整的第三磨牙，将离体牙置入碘伏中浸泡1分钟，用无菌生理盐水冲净牙齿表面血迹，用无菌咬骨钳沿釉牙骨质界打开髓腔，镊子取出牙髓，并剪除近根部牙髓组织，选用反应酶与剪碎的牙髓组织混合消化1小时，将消化后的组织置于离心机中以1000rpm/min转速，离心5分钟，弃去上清液，加入完全培养基中，吹打混匀，经70 µm的细胞金属网过滤，将获得的细胞悬浮液接种于10cm培养箱中，加入完全培养液进行培养，所述培养箱培养条件为相对湿度100%，5%CO2，37℃；3天更换一次培养液，细胞融合达到70%‑80%后，室温条件下，0.25%胰蛋白酶消化2分钟，1000rpm/min离心5分钟，弃除上清，吹打沉淀，混匀后以1:3比例传代，每3天换液1次，取第三代牙髓干细胞进行观察；（2）牙髓干细胞成软骨分化鉴定：取第三代牙髓干细胞制成2×105 细胞/ml的细胞悬液，取1ml的步骤（1）中的细胞悬液加入到15ml离心管，在1000rpm/min转速下离心5分钟，分化组加入成软骨培养液, 对照组加入完全培养液，培养4周后取材检测成软骨分化情况，取材后将标本放入4%多聚甲醛中固定24小时，20%蔗糖固定2天，30%蔗糖固定3天，组织嵌入O.T.C.化合物包埋，切成5μm厚切片，取出切片，置于烘箱内，37℃下放置30分钟，0.01M PBS液中漂洗两次，每次漂洗5分钟，甲苯胺蓝染色观察细胞外基质中糖胺多糖分泌情况；（3）牙髓干细胞成脂分化鉴定：取第三代牙髓干细胞以3,000个/cm2密度接种于6孔中，分化组加入成脂分化培养液，对照组加入完全培养液，2‑3天更换一次培养基，诱导分化3周，吸弃细胞培养液，0.01 M PBS冲洗5min×3次，4%多聚甲醛中固定1小时，0.01 M PBS冲洗5 min×3次，吸干后油红染色30min，60%乙醇分色至背景清晰，蒸馏水冲洗后显微镜下观察见串珠状圆形透明脂滴形成；（4）多孔壳聚糖支架的制备：将壳聚糖粉末溶于密度为1%的醋酸溶液中配制成密度为2%的溶液,向24孔培养板每孔中加入密度为2%壳聚糖醋酸溶液1ml置于4℃环境下，放置6h,再置于‑28℃冷冻过夜后, 再放入‑60℃下冷冻干燥24h，向培养板每孔中加入0.1 mol/L的NaOH溶液1ml碱化20 min,再用pH为7.2的0.01 mol/L的PBS清洗3次,最后再进行两次冷冻干燥，壳聚糖支架接种细胞前用70%的乙醇先灭菌, 再用无菌的生理盐水清洗3次,最后经紫外灯照射干燥20 min；（5）共培养：细胞每次接种前先从培养皿中吹打下来，加入灭菌后的壳聚糖支架，吸取含有游离干细胞的培养液,最后将载有牙髓干细胞的壳聚糖支架放入培养箱中进行培养，培养箱培养条件为相对湿度100%、5%CO2、37℃，24h后可检测细胞吸附情况及进行后续实验。...
【技术特征摘要】
1.一种牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备方法，其特征在于：经过人牙髓干细胞的分离与原代培养、牙髓干细胞成软骨分化鉴定、牙髓干细胞成脂分化鉴定、多孔壳聚糖支架的制备和共培养步骤完成牙髓干细胞与壳聚糖支架复合体的制备；所述具体步骤如下：（1）人牙髓干细胞的分离与原代培养：取临床上被拔出的完整的第三磨牙，将离体牙置入碘伏中浸泡1分钟，用无菌生理盐水冲净牙齿表面血迹，用无菌咬骨钳沿釉牙骨质界打开髓腔，镊子取出牙髓，并剪除近根部牙髓组织，选用反应酶与剪碎的牙髓组织混合消化1小时，将消化后的组织置于离心机中以1000rpm/min转速，离心5分钟，弃去上清液，加入完全培养基中，吹打混匀，经70µm的细胞金属网过滤，将获得的细胞悬浮液接种于10cm培养箱中，加入完全培养液进行培养，所述培养箱培养条件为相对湿度100%，5%CO2，37℃；3天更换一次培养液，细胞融合达到70%-80%后，室温条件下，0.25%胰蛋白酶消化2分钟，1000rpm/min离心5分钟，弃除上清，吹打沉淀，混匀后以1:3比例传代，每3天换液1次，取第三代牙髓干细胞进行观察；（2）牙髓干细胞成软骨分化鉴定：取第三代牙髓干细胞制成2×105细胞/ml的细胞悬液，取1ml的步骤（1）中的细胞悬液加入到15ml离心管，在1000rpm/min转速下离心5分钟，分化组加入成软骨培养液,对照组加入完全培养液，培养4周后取材检测成软骨分化情况，取材后将标本放入4%多聚甲醛中固定24小时，20%蔗糖固定2天，30%蔗糖固定3天，组织嵌入O.T.C.化合物包埋，切成5μm厚切片，取出切片，置于烘箱内，37℃下放置30分钟，0.01MPBS液中漂洗两次，每次漂洗5分钟，甲苯胺蓝染色观察细胞外基质中糖胺多糖分泌情况；（3）牙髓干细胞成脂分化鉴定：取第三代牙髓干细胞以3,000个/cm2密度接种于6孔中，分化组加入成脂分化培养液，对照组加入完全培养液，2-3天更换一次培养基，诱导分化3周，吸弃细胞培养液，0.01MPBS冲洗5min×3次，4%多聚甲醛中固定1小时，0.01MPBS冲洗5min×3次，...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯兴梅，李立人，顾志峰，黄丹，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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