靶向神经元和神经胶质人类胚胎干细胞系制造技术

本发明专利技术涉及包含靶向基因构建体的人类干细胞系，并且特别涉及包含经由同源重组插入Ｏｌｉｇ２基因座内的报道基因的人类胚胎干细胞系（ｈＥＳＣ）。ｈＥＳＣ系仍是多能的，并且维持正常核型，并且允许通过荧光显微镜检查和通过ＦＡＣＳ的分选显现Ｏｌｉｇ２。因为Ｏｌｉｇ２在运动神经元和少突胶质细胞的发育中是重要的，所以本发明专利技术提供了研究干细胞分化成运动神经元和少突胶质细胞，以及研究影响此种分化的固有和外源性因子的方法。本发明专利技术的ｈＥＳＣｓ还提供了研究和测定用于细胞分化的优化因子和条件的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及包含靶向基因构建体的人类干细胞系，并且特別涉及包含经由同源重组插入01 ig2基因座内的报道基因的人类胚胎干细胞 系。
技术介绍
人类干细胞具有充当实验模型以研究在体内不易取得的人类发育 的方面的潜力。人类干细胞还具有在研究负责疾病发作和进展的分子 和细胞机制中有用的潜力。Menedez等人，Current Gene Ther. 5: 375-85 ( 2005 )。其为位于染色体中的DNA序列与新引入的DNA序列的同源重组的 基因靶向提供了用于特异性改变哺乳动物基因组的方法。Thomas和 Capecchi, Cell 51: 503-512 ( 1987 )。基因靶向已应用于小鼠胚胎 干细胞(mESC)系，以研究神经元分化。Xian等人，Stem Cells 21: 41-49 ( 2003 )描述了包含关于01ig2基因座的GFP敲入的inESCs ( RW4 ES)的产生。Xian和Gottlieb, Glia 47: 88-101 ( 2004 )报告了 GFP-01ig2敲入mESCs的使用(如Xian 2003中所述)。Xian等人， Biochem. Biophys. Res. Comm. 327: 155-162( 2005 )描述了 GFP-01ig2 敲入小鼠的使用(Xian， 2003 )，以开发用RA和Shh的培养条件，用 于ES细胞沿着神经通路的快速和有效分化以用于HTS潜力。然而，人类干细胞中的基因靶向已证明是困难的。Zwaka和 Thomson, Nature Biotech. 21: 319-321 ( 2003 )报告难以达到在人 类胚胎干细胞(hESCs)中高的、稳定转染率，并且对于mESCs建立的 电穿孔方案在hESCs中工作很差。Yates和Daley,Gene Ther. 13(20): 1431-9 )( 2006 )报告HR(同源重组)在hESCs中未广泛采用(与mESCs 比较)，并且迄今仅存在3个HR靶向hESC系(2个HPRT系和1个0ct44系)。根据该作者，这是部分由于在将DNA转染到hESCs内遇到的主要困难。此外，迄今，仍未靶向在未分化的人类干细胞中未表达的基因。因此，本领域需要在基因中包含靶向突变的人类干细胞系，所述基因在未分化的人类干细胞中表达。专利技术概述本专利技术涉及包含靶向基因构建体的人类干细胞系，并且特别涉及包含经由同源重组插入01ig2基因座内的报道基因的人类胚胎干细胞系。因此，在某些实施方案中，本专利技术提供了包含插入基因内的报道基因的人类干细胞，所述基因在分化前在所述人类干细胞中不表达。在某些实施方案中，人类干细胞是胚胎干细胞。在某些实施方案中，报道基因插入olig2基因座内。在某些实施方案中，报道基因编码荧光蛋白质。在某些实施方案中，荧光蛋白质选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白。在进一步的实施方案中，本专利技术提供了包含前迷人类干细胞的分离的干细胞系。在进一步的实施方案中，本专利技术提供了包含前述人类干细胞的体外细胞培养物。在某些实施方案中，本专利技术提供了包含前述人类干细胞的生物体。在再进一步的实施方案中，本专利技术提供了包含前述人类干细胞的組织。在某些实施方案中，本专利技术提供了筛选化合物的方法，其包括a)提供包含插入基因内的报道基因的人类干细胞，所述基因在分化前在所述人类干细胞中不表达；b)使所述人类干细胞与所述至少一种化合物接触；c)培养所述人类干细胞；和d)就所迷报道基因的表达测定所述人类干细胞。在某些实施方案中，人类千细胞包含插入0Ug2基因座内的报道基因。在某些实施方案中，测定通过选自荧光显微镜检查和荧光激活细胞分选的方法来执行。在某些实施方案中，培养包括在这样的条件下培养所述人类干细胞，使得允许所述人类干细胞分化。在某些实施方案中，提供了多个细胞，并且所述接触步骤包括在高流通量测定法中使所述多个细胞与化合物文库接触。在某些实施方案中，化合物选自蛋白质、肽、多肽和小有机化合物。在某些实施方案中，人类干细胞是胚胎千细胞。在某些实施方案中，该方法进一步包括选 择化合物的步骤。在某些实施方案中，该方法进一步包括在人类动物 中测试所述化合物的步骤。在某些实施方案中，该方法进一步包括包 装所述化合物用于在动物中使用的步骤。在某些实施方案中，本专利技术进一步提供了筛选神经毒素的方法，其包括提供a)提供包含插入01ig2基因座内的报道基因的人类干细 胞；b )使所述人类干细胞与怀疑是神经毒素的所述至少一种化合物接 触；和c)就所述报道基因的表达测定所述人类干细胞。在某些实施 方案中，测定通过选自荧光显微镜检查和荧光激活细胞分选的方法来 执行。在某些实施方案中，人类干细胞是胚胎千细胞。 附图描述图l提供了关于人类01ig2的序列。图2提供了本专利技术的0Hg2报道基因(绿色荧光蛋白)构建体的序列。 定义如本文所使用的，术语干细胞意指全能或多能或多潜能的并且能够分化成一个或多个不同细胞类型的细胞。如本文所使用的，术语胚胎干细胞意指衍生自受精后约7天 的胚胎的干细胞。如本文所使用的，术语 体的干细胞。如本文所使用的，术语 相关的特征的细胞系。如本文所使用的，术语 细胞相关的特征的细胞系。如本文所使用的，术语神经细胞系意指显示通常与神经细胞 系相关的特征的细胞系。此种特征的例子包括但不限于，GFAP、神经 元特异性烯醇酶、Neu-N、神经丝-N或tau的表达。如本文所使用的，术语全能的意指细胞分化成分化生物体中'成人干细胞意指衍生自出生后的生物 '中胚层细胞系意指显示与中胚层细胞 '内胚层细胞系意指显示通常与内胚层的任何细胞类型，以及胚胎外材料例如胎盘的细胞的能力。如本文所使用的，术语多能的指能够分化成任何分化的细胞类型的细胞系。如本文所使用的，术语多潜能的指能够分化成至少2个分化的细胞类型的细胞系。如本文所使用的，术语分化如就分化细胞系统中的细胞而言使用的，指通过其细胞从一个细胞类型(例如，多潜能、全能或多能的可分化细胞)分化成另一个细胞类型例如靼分化细胞的过程。如本文所使用的，术语细胞培养指细胞的任何体外培养。这个术语内包括的是连续细胞系(例如具有永生化表型)、原代细胞培养、有限细胞系(例如非转化细胞)、和在体外维持的任何其他细胞群体，包括卵母细胞和胚胎。如本文所使用的，术语报道基因或报道构建体指包括编码蛋白质的核酸的遗传构建体，所述蛋白质可容易地检测或可容易地测定，例如有色蛋白质、荧光蛋白质或酶例如P-半乳糖苷酶。如本文所使用的，术语基因靶向指外源DNA整合到细胞基因组内在其中它的表达可以合适地控制的位点处。这种整合作为同源重组的结果而发生。如本文所使用的，敲入方法指经由同源重组将所需核酸序列例如编码报道基因的序列插入宿主细胞中的特定基因座内的操作。如本文所使用的，术语基因组指生物体的遗传材料(例如染色体)。术语目的核苷酸序列指任何核苷酸序列(例如RNA或DNA ),其的操作可以由本领域普通技术人员认为由于任何原因(例如治疗疾病、赋予改良的特性、目的蛋白质在宿主细胞中的表达、核酶的表达等)希望的。此种核苷酸序列包括但不限于，结构基因(例如报道基因、选择标记基因、癌基因、药物抗性基因、生长因子等)的编码序列，和不编码mRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含靶向进入基因内的报道基因的人类干细胞，所述基因在分化前在所述人类干细胞中不表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-3-28 60/920,457;US 2008-3-27 12/056,8231.包含靶向进入基因内的报道基因的人类干细胞，所述基因在分化前在所述人类干细胞中不表达。2. 权利要求1的人类干细胞，其中所述人类干细胞是胚胎千细胞。3. 权利要求1的人类干细胞，其中所述报道基因靶向进入olig2 l因座内。4. 权利要求1的人类干细胞，其中所述报道基因编码荧光蛋白质。5. 权利要求1的人类干细胞，其中所述荧光蛋白质选自绿色荧光 蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白。6. 权利要求1的人类干细胞，其中所述报道基因通过同源重组靶向。7. 分离的干细胞系，其包含权利要求1的人类干细胞。8. 体外细胞培养物，其包含权利要求1的人类干细胞。9. 生物体，其包含权利要求1的人类干细胞。10. 組织，其包含权利要求1的人类千细胞。11. 篩选化合物的方法，其包括a) 提供包含靶向进入基因内的报道基因的人类千细胞，所述基因 在分化前在所述人类干细胞中不表达；b) 使所述人类干细胞与所述至少一种化合物接触；c) 培养所述人类干细胞；和d) 就所述报道基因的表达测定...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪敏，
申请(专利权)人：巴克老年研究所，
类型：发明
国别省市：US[美国]