神经胶质细胞促有丝分裂因子,其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了对编码若干多肽的ＤＮＡ的鉴定与纯化，这些多肽用于刺激神经胶质细胞（尤其是施旺细胞）的有丝分裂和治疗神经胶质细胞瘤。本发明专利技术还公开了这些ＤＮＡ的序列，其编码的新型多肽可用于刺激神经胶质细胞的有丝分裂和治疗神经胶质细胞瘤。本发明专利技术提供了用于神经胶质细胞相关疾病治疗和诊断目的的已知和新型多肽的合成、纯化和检测的方法。本发明专利技术还提供了利用这些多肽制备用于治疗和诊断神经胶质细胞相关疾病的抗体探针的方法。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
相关申请的参考本申请为如下申请的部分继续申请系列号No.08/036,555，申请日1993-3-24，系列号No.07/965,173，申请日1992-10-23，系列号No.07/940,389，申请日1992-9-3，系列号No.07/907,138，申请日1992-6-30，系列号No.07/863,703，申请日1992-4-3。本专利技术的背景本专利技术涉及存在于脊椎动物中的若干多肽，这些多肽为神经胶质细胞包括施旺细胞的促有丝分裂生长因子。本专利技术还涉及能够制备这些因子的方法，以及这些因子在治疗上的应用。脊椎动物神经胶质细胞构成了中央和周围神经系统的特异的连接组织。重要的神经胶质细胞包括施旺细胞，它为神经元提供代谢支援，并为某些周围神经元的轴突提供髓磷脂鞘，因而形成各神经纤维。施旺细胞在邻近的神经元的轴突周围形成同轴的膜层，并围绕轴突生长、扭转，支持神经元，并提供鞘的作用。这些髓磷脂为许多神经纤维的易感因子，而且，施旺细胞的损伤或生长发育的失常，可导致许多周围神经系统疾病和失调，如严重的脱髓鞘或神经退化等病征。在神经系统的发育中，很显然，细胞需有各种因子调节其分化与生长，而近年来各种此类因子已经得到了鉴定，其中包括已发现的一些对于施旺细胞分化或发育起作用的因子。Brockes等，(另有其它文献)，于“神经科学杂志”(J.Neuroscience，4，(1984)75-83)上描述了一种从牛脑和脑垂体组织的抽提物中得到的蛋白质生长因子，命名为神经胶质生长因子(Glial Growth Factor，GGF)，该因子刺激在含10％牛胎血清培养基中培养的鼠的施旺细胞分化。该因子据描述分子量为31,000道尔顿并易形成二聚体。在“酶学方法”(Meth.Enz.，147(1987)，217-225)中描述了一种以施旺细胞进行的GGF试验。Brockes等，(文献同上)，还描述了一种使GGF明显均质的纯化方法。简要地，其描述的一种大量纯化的方法包括从冷冻牛前叶中抽提，得到的样品材料进行层析，从CM-纤维素上用NaCl梯度洗脱。然后用Ultrogel柱进行凝胶过滤，接着用磷酸-纤维素柱洗脱，最后是小量SDS-凝胶电泳。方法也可变动，以CM-纤维素材料直接应用于磷酸纤维素柱，收集过柱组分并以天然制备凝胶电泳纯化，随后进行最后的SDS凝胶电泳。Brockes等发现以前的报道的凝胶过滤实验中(Brockes等(“生物化学杂志”J.Biol.chem.225(1980)8374-8377)，生长因子的活性主峰迁移至分子量56,000道尔顿，而在上述的前一种流程中，更具活性的部分为分子量31,000道尔顿。据称，在此流程中经过CM-纤维素梯度洗脱后，使得GGF二聚体被大大地去除了。Benveniste等(PNAS，82(1985)，3930-3934)描述了一种T淋巴细胞衍生的神经胶质生长促进因子。这种因子在还原条件下，SDS-凝胶上呈现出明显的分子量变化。Kimura等(“自然”，Nature，348(1990)，257-260)描述了从一坐骨神经鞘肿瘤中得到的一种因子，称之为神经鞘瘤衍生生长因子(Schwannoma-derived growth factor，SDGF)。作者称SDGF并不刺激氚标记的TdR进入施旺细胞，而与之相反，在同样条件下，含有GGF的部分纯化的脑垂体组分却有此活性。SDGF的表观分子量处于31000D至35000D之间。Davis和Stroobant(细胞生物学杂志，J.Cell.Biol.，110(1990)1353-1360)描述了对若干候选促有丝分裂剂的筛查。实验使用大鼠施旺细胞，培养基含有10％FCS(牛胎血清)，在加入或不加入forskolin的条件下，测试各待测样品对施旺细胞中DNA合成的刺激能力。这些被测试的因子之一为GGF-羧甲基纤维素组分(GGF-CM)，当FCS存在，不论有否forskolin，它都具有促细有丝分裂作用。这项工作揭示，在forskolin存在下(主要条件，也需其它)，血小板衍生的生长因子(PDGF)对施旺细胞是一有效的促有丝分裂剂。PDGF从前曾被以为对施旺细胞没有作用。Holmes等(“科学”，Science(1992)2561205)和Wen(“细胞”，Cell(1992)69559)称，编码与受体(p185erbB2)结合的蛋白质DNA序列，与多种人类肿瘤相关。p185erbB2蛋白是一185KD的跨膜蛋白，具有色氨酸激酶活性。该蛋白由erbB2原癌基因编码(Yarden和Ullrich“生化年评”Ann.Rev.Biochem.57443(1988))。erbB2基因，也称HER-2(在人细胞中)，和neu(在鼠细胞中)，它与表皮生长因子(EGF)的受体紧密相关。近来的证据表明与p185erbB2相互作用的蛋白(和激活p185erbB2激酶的蛋白)能诱导携带p185erbB2受体的细胞的增殖(Holmes等Science 2561205(1992)；Dobashi等Proc.Natl.Acad.Sci.888582(1991)；Lupu等Proc.Natl.Acad.Sci.892287(1992))。再有的证据是，表达p185erbB2结合蛋白的基因产生许多大小不同、差异剪切的RNA转录产物，因而产生一系列的蛋白质，它们具有不同的长度，但具有一些共同的肽序列和特定的肽序列。人乳腺癌(MDA-MB-231)中得到的差异剪切的RNA转录产物支持了这点(Holmes等Science 2561205(1992))。更进一步的支持是作为p185erbB2受体的配体的蛋白(本专利技术公布于此)，该蛋白具有宽广的长度变化范围(见下文)。本专利技术概述总体上，本专利技术提供了刺激神经胶质细胞(尤其是施旺细胞和中央神经系统的神经胶质)有丝分裂的方法，以及呈现这种神经胶质细胞促有丝分裂活性的新型蛋白。此外，本专利技术还提供了编码这些蛋白DNA，和编码与之或相关蛋白结合的抗体的DNA。本专利技术的新型蛋白包括编码由已知多肽的序列经可变的剪切而成的产物。总的来说，这些已知蛋白为GGF/p185erbB2蛋白家族的成员。特别指出，本专利技术提供了含有一特异通式的若干多肽，以及编码这些多肽的DNA序列。这些多肽含有如下的通式WYBZCX其中，WYBAZCX由如图3l所示氨基酸序列组成(SEQ ID Nos.136-139，141-147，160，161，173-178，42-44，77)；；其中的W含有多肽片段F，或不含有；其中的Y含有多肽片段E，或不含有；其中的Z含有多肽片段G，或不含有；其中的X含有多肽片段C/D HKL，C/DH，C/D HL，C/D D，C/D′HL，C/D′HKL，C/D′H，C/D′D，C/D C/D′HKL，C/DC/D′H，C/D C/D′HL，C/D C/D′D，C/D D′H，C/D D′HL，C/D D′HKL，C/D′D′H，C/D′D′HL，C/D′D′HKL，C/D C/D′D′H，C/D C/D′D′HL或C/D C/D′D′HKL；在此情况下，要么a)F，Y，B，A，Z，C，或X至少其中之一为牛来源的；或者b)Y含有多肽片段E；或者c)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种碱性的具有促进神经细胞有丝分裂活性的多肽因子，其中所述的多肽因子缺失氨基末端信号序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁大卫古德尔，保罗斯特鲁本特，路易莎明盖蒂，迈克尔沃特菲尔德，马克马尔基翁尼，陈麦苏，伊恩希尔斯，
申请(专利权)人：路德维格癌症研究所，坎布里奇神经科学，
类型：发明
国别省市：US[美国]