采用湍流冷却气流控制凝胶电泳期间的温度梯度制造技术

一种凝胶电泳分离装置，包括下述部件之结合；气体热交换介质、气体热交换介质驱动设备、和冲击设备。由此，气体热交换介质驱动设备驱使气体热交换介质穿过冲击设备，提供气体热交换介质在凝胶板表面上流动。从而，由气体热交换介质穿过冲击设备流通诱导的气流，借助强制对流作用，将凝胶中的温度梯度降至最小。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及进行DNA测序时，采用板式凝胶电泳对单链DNA片段的分离。具体说来，本专利技术涉及借助板式凝胶电泳进行DNA顺序分析的装置，该装置包括一种以湍流气体热交换介质冲击为基础的温度控制部件。本专利技术突击特点是，电泳期间凝胶分离介质中产生的热温度梯度降至最小。因此，使用本专利技术装置，将改善DNA顺序分析的速度，可靠性及清晰度。凝胶电泳是一项基本生化分离技术，它成为根据分子大小、电荷或二者结合，来区分各种生物学重要分子之基础。采用凝胶电泳能很好分离的生物分子的具体例包括蛋白质和核酸。电泳通常在含有电导缓冲液的胶状物(如琼脂糖)或高聚物(如聚丙烯酰胺)介质(一般称为“凝胶”)中进行。借助穿过凝胶截面的化学惰性金属电极施加电压，方进行电泳。所要研究的生物样品，置于该凝胶中预先形成的样品井中(sample well)，该井通常位于凝胶一端，所施加电压的极性要使得该生物样品通过凝胶朝电极之一泳动(迁移)(通常指位于与样品相对的凝胶一端之电极)。假如适宜，可通过加入化学改性剂(如脲、甲酰胺、或十二烷基硫酸钠)至凝胶，以及电泳缓冲液，来维持泳动距离和分子大小之间的反线性关系。凝胶电泳的特殊应用，是测定所研究核酸的核苷酸顺序时，分离单链DNA片段。为此目的，要汇集经核酸化学降解产生(使用Gilbert法，例如见Maxam和Gilbea(1980)，Methods Enzyme，65，P499-500)，或使用聚合酶进行替换DNA合成产生(采用Sanger法，例如见Sanger，F.，Niklen，S.，和Coulson，A.R.(1977)，Proc.Nat.Acad.Sci.USA74，P5463-5467)的单链DNA片段。所汇集的单链DNA片段，包括与欲测定顺序中各位置相对应的片段，在最频繁使用的测序法中，此种对应直接关系到退火的引物中聚合反应引发固定位点至欲测序核酸之距离。因而，所需顺序的测定取决于各片段的分离，这些片段的长度差别只有一个核苷酸。对各位置各自可能的核苷酸的鉴别(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷)，传统方法是，在单独的化学反应混合物中，进行对各末端核甘酸具特异性的测序反应来加以区分。这样，一般在4个分开的试管中进行各个测序实验，在这些试管中，形成各末端处于与该反应所利用的末端核苷酸相对应位置处的各种片段之汇集。然后，将一组4种反应物各自进行改性(dena turing)凝胶电泳测定核苷酸顺序，每种反应物在单一测序凝胶的相邻泳道中独自电泳。该凝胶的某核苷酸特异泳道中某位置上存在的谱带，便表明鉴定出所测顺序中，该位置上有此种核苷酸。使用常规技术，将各片段进行放射性标记，电泳之后，借助放射自显影法可使这些谱带显现出来。此外，最近的技术改进开发出自动测序机。此种机器在与载样井相对的凝胶末端装有分光光度检测装置。使用荧光标记引物，或荧光标记核苷酸合成DNA片段。在每种情况下，各核苷酸反应分别连续进行，其中用有区别的荧光标记物来对相应于各核苷酸的片段进行荧光标记。然而，因为每种荧光标记物表现出特性频率的荧光发射作用，因此可从其荧光发射信号来区分各片段末端位置所要鉴定的核苷酸。该特征使得可以用该装置借助分光光度法自动化汇集核苷酸顺序资料。另外，各片段存在不同荧光信号，也使得四种分开的定顺反应产物可在凝胶的单一泳道进行电泳。这些技术的开发，提高了对核苷酸测序反应中产生的测序片段精确和可靠分离之要求。然而，就该
现状来说，现有板式凝胶电泳技术存在许多尚未解决的固有技术局限性。例如，由于对区分分离片段范围的局限性，迫使各测序反应物系列加样于凝胶上时要分两次加于两组泳道中。第一次加样的泳道(由此电泳最长)用于测定距聚合反应引发位最远的核苷酸顺序(因而是最长的片段)，而第二次加样的一组被理解为测定最靠近引发位的核苷酸顺序。加样的相对时间安排和允许反应物的电泳时间靠经验选择，以使这些范围相符(overlap)，这样，便可以看到任何特定核苷酸顺序的一个完整部份。该电泳的这些局限性的结果是，可从给定位点引发的测序反应，看到最多350-400碱基。因此，若开发能分辨比目前可能的长度较长之核苷酸顺序的方法和装置，将是对该领域有益的促进。对使用常规电泳技术能获得核苷酸顺序资料之程度的许多其它技术局限性，在于使用板式凝胶电泳分析DNA顺序所需电泳条件造成的。其中最为显著仍是电泳期间凝胶中所产生的热温度梯度。为了按各片段长度比例以电泳分离开单链DNA片段，一般在凝胶两端施加1000-3000伏电势2-16小时。有大约30-60瓦能量在凝胶中作为热均匀消耗掉，然后从含板式凝胶的凝胶板表面消散。此种热是有用的(实际上是必需的)，因为它促使单链DNA处于变性状态(以使泳动距离与片段长度成反比)。但是此种生热程度限制于包括电泳设备在内的材料耐热度。这种限制限制了所施加电压的最高幅度，因为电泳持续时间取决于所加电压的幅度，缩短电泳时间的能力也受到所加能量幅度的制约。伴随DNA测序凝胶生热的另一问题是该热在整个凝胶中分布不均衡，结果凝胶中产生热温度梯度。在常规改性丙烯酰胺凝胶条件下，电泳期间，该凝胶中心1/4-1/3之处要比全长其余部份热。因为单链DNA片段的流动性随温度按比例改变(每℃提高约2.2％比例)，不均衡加热造成中心泳道的样品比边缘样品泳动快。该结果使得其泳道谱带图形横穿凝胶呈现“微笑”状的测序凝胶从凝胶中心朝边缘，该谱带逐渐偏向阳极(采用常规技术即朝上)。另一现有技术尚未解决的严重问题是与高电压板式凝胶电泳相关的问题-产生前后热温度梯度。特别是测序凝胶各泳道中每条谱带与所有其它谱带的分辨率受这些类型热梯度的影响。谱带分辨率取决于每条带的尺寸(即厚度)，以及各带平均厚度和分隔各带的空间宽度之间的关系。由厚带组成的测序阶梯平均比较薄凝胶(即拆分带更紧者)，含较少可分辨带，只是由于该凝胶拆分带长度有限的缘故。同时，因为原则上测序凝胶中各带小至一个核苷酸均可分开，那么具多重特定核苷酸(如5＇-TTTTTTTTT-3＇)的DNA展开后，在较厚凝胶(拆分带欠紧密)中，比在较薄凝胶(拆分带较紧密)中分辨更为困难。虽然该因素对于拆分一种核苷酸重复展开的链特别重要(因为在同一泳道中进行的相应于这些核苷酸每一种的单链DNA片段电泳，该现象更为严重)，但此种与带宽相关的谱带分辨率问题，也出现在跨越一条以上凝胶泳道的某些凝胶部份(称之为“凝缩区”(compression zone))。这些问题已由现有技术正视，正如采用-标记的脱氧核苷酸标记测序反应中的DNA所证实的一样(见Sambrook等人，出处同上)。因为35S发射较低能量粒子在放射自显影膜较窄面转换银颗粒，所以由来自35S的β-粒子发射产生的放射自显影带带宽，要比32P β-粒子发射产生的带宽窄些。此种窄带的有用性，尽管伴随35S使用会面临很多实际缺点，而其仍是该领域一种可接受的方法而得到证实(这些缺点包括较长的放射自显影时间)。使用高电压板式凝胶电泳分离的单链DNA片段带宽的主要决定因素是高压电泳期间该凝胶中产生的前后热温度梯度。因此，在DNA测序/凝胶电泳领域，在前后以及左右热温度梯度降至最小的条件下进行高电压板式凝胶电泳所用设备，仍有未尽人意及不能满足需要之处。因此，现有技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种凝胶电泳分离装置，包括下述组合：气体热交换介质，气体热交换介质驱动设备，和冲击设备，由此，气体热交换介质驱动设备驱使气体热交换介质穿过冲击设备，以在凝胶板表面提供气体热交换介质流，从而，借助穿过冲击设备的气体热交换介质的流通而产生的该气流，通过强制对流方式，将凝胶中的温度梯度降至最小。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：道格拉斯H史密斯，布赖恩J米夫萨德，迪安S伯吉，托马斯E戴维斯，史蒂文M冯哈伊斯蒂，
申请(专利权)人：杰诺米克斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]