用含氨基酸的缓冲液通过毛细管电泳分离蛋白质的方法技术

在含有一种或多种氨基酸的缓冲液中，通过毛细管电泳而分离蛋白质混合物，其中氨基酸的量足以防止或大大减少蛋白质结合于毛细管壁的程度。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质电泳领域，而且论述在通过毛细管电泳在蛋白质分离中得到高分辨力的方法。
技术介绍
分析哺乳动物血清中蛋白质的水平，已被广泛地用作各种疾病和异常生理状况的指示手段。例如，低于正常水平的白蛋白是肾脏疾病的征兆，而高浓度的白蛋白则是脱水的特征。类似地，前-β脂蛋白水平的升高可以是慢性酒精中毒或雌激素过多症的征兆，而β-脂蛋白水平的升高可以是高胆固醇的征兆。蛋白质可方便地通过电泳而分离，板凝胶电泳和毛细管电泳都已被应用。毛细管电泳的好处是，可以分析非常少的样品，而且由于毛细管中壁表面与体积之比高，电流所产生的热量可以很快地被散发掉，从而可以在高压下进行电泳，因而缩短了分离时间。开放式毛细管区带电泳(其中分离介质是缓冲溶液)特别有用，因为对于每次使用，毛细管可方便地加以调节并注入溶液。一旦施加电场，在毛细管壁表面处的电动势是蛋白质移动和分离中的主要因素。蛋白质和毛细管壁之间的相互作用可改变这种移动和分离。在高或低pH下进行的分离(这样会使蛋白质带净电荷)可减少蛋白质和毛细管壁之间的相互作用。这种相互作用在用熔凝氧化硅制成的毛细管中特别强，从而造成蛋白质被吸附在毛细管壁上。通过改变壁表面的电荷密度，吸附作用对电渗流会产生影响。电渗流的改变反之会改变迁移时间、峰分辨力和重复性。尽管影响程度更低，但是这些因素也适用于板电泳，尤其是使用薄板电泳时。为了通过抑制蛋白质与毛细管壁或其他包括在分离区带中的壁之间的相互作用而改善分离的努力，已导致开发出众多处理方法、添加剂和操作条件。一种技术是使用pH高于样品蛋白质的等电点的缓冲液，从而赋予蛋白质净负电荷，将它们从带负电荷的壁上排斥开。该方法的缺点是蛋白质可能会水解以及发生其他的结构变化。盐浓度高的强碱性缓冲液也已被用作阻断蛋白质与壁之间的离子相互作用的手段。然而，高盐浓度增加了缓冲液的导电性，因而增加了毛细管内热量产生的速度。另一种方法是涂覆壁以掩饰或中和电势，而用于该目的的涂料包括聚丙烯酰胺、乙二醇和五氟苯甲酰基。涂覆的壁的缺点有由于重复使用过程中涂层的逐渐破坏而导致重复性低，以及消除了电内渗流分量而导致分析速度的下降。另一种方法是在电泳缓冲液中包含硼酸根离子，以便与糖蛋白的糖部分形成复合物从而中和它们的电荷。使用硼酸根离子可能会使某些蛋白质尤其免疫球蛋白变性，从而形成分开的峰。同样，硼酸根离子会增加缓冲液的导电性，限制了电场和分离所能到达的速度。专利技术概述现在发现，通过使用含有氨基酸的碱性电泳缓冲液，可以在没有蛋白质-壁相互作用的不利特性下，通过毛细管电泳而实现有效的和快速的蛋白质分离。这种缓冲液普遍适用于电泳，其中包括各种几何结构的电泳池，但是它对于在毛细管中进行的电泳特别适用。含氧化硅材料的毛细管，尤其内部没有涂覆过的熔凝氧化硅毛细管是优选的。在最佳的使用中，含有氨基酸的缓冲液被用于加入样品之前毛细管或其他电泳池的预处理，被用作加入样品时样品的稀释缓冲液，以及被用作构成电源和分离区域之间电通路的两个电极液槽中任一个中的电极缓冲液。氨基酸减少了蛋白质-壁之间的相互作用以及蛋白质-蛋白质之间的相互作用，而且避免了变性的危险。因此，用本专利技术缓冲液进行的分离可以提供板凝胶电泳所能达到的相同或等价的分离效果，而且精度高、分辨力高、重复性高。本专利技术的这些和其他特征及优点，通过下列的描述将更明显。附图简述附图说明图1是用本专利技术缓冲液通过毛细管区带电泳分析正常血清样品的电泳图。图2a是用本专利技术缓冲液通过毛细管区带电泳分析正常血清样品的电泳图，其中使用一套不同于图1的操作条件。图2b是用本专利技术范围之外的缓冲液通过板凝胶电泳分析与图2a相同的血清样品的光密度扫描图。图3a是用本专利技术的缓冲液进行的毛细管区带电泳，分析患单克隆丙种球蛋白病的对象的血清样品的电泳图。图3b是用本专利技术范围之外的缓冲液通过板凝胶电泳分析与图3a相同的血清样品的光密度扫描图。图4a是用本专利技术的缓冲液进行的毛细管区带电泳，分析患多克隆丙种球蛋白病的对象的血清样品的电泳图。图4b是用本专利技术范围之外的缓冲液通过板凝胶电泳分析与图4a相同的血清样品的光密度扫描图。图5a是用本专利技术的缓冲液进行的毛细管区带电泳，分析患IgA单克隆丙种球蛋白病并有正常IgG的对象的血清样品的电泳图。图5b是用本专利技术范围之外的缓冲液通过板凝胶电泳分析与图5a相同的血清样品的光密度扫描图。图6a是用本专利技术的缓冲液进行的毛细管区带电泳，分析一对象的血清样品的电泳图，该对象患双克隆或寡克隆丙种球蛋白病且α1和α2升高。图6b是用本专利技术范围之外的缓冲液通过板凝胶电泳分析与图6a相同的血清样品的光密度扫描图。图7a是用本专利技术的缓冲液进行的毛细管区带电泳，分析患小单克隆(minimonoclonal)丙种球蛋白病的对象的血清样品的电泳图。图7b是用本专利技术范围之外的缓冲液通过板凝胶电泳分析与图7a相同的血清样品的光密度扫描图。图8a是用本专利技术缓冲液进行的毛细管区带电泳所获得的白蛋白峰面积与用本专利技术范围之外的缓冲液进行的板凝胶电泳所获得的白蛋白峰面积之间的相关性图。图8b是类似于图8a的相对α1球蛋白峰面积的相关性图。图8c是类似于图8a的相对α2球蛋白峰面积的比较图。图8d是类似于图8a的相对β球蛋白峰面积的比较图。图8e是类似于图8a的相对γ球蛋白峰面积的比较图。专利技术详述和优选实施例氨基酸在本专利技术中之所以有效是因为它们在高pH条件下因羧基(-COO-)的离子化而带负电荷。有用的氨基酸包括必需和非必需氨基酸。某些主要氨基酸的例子包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸和谷氨酰胺。其中优选的是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸，更佳的是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。优选的氨基酸类别是α-氨基酸，尤其是那些在水溶液中导电率较低的种类如甘氨酸。可在一个缓冲液中使用2种或多种氨基酸而不是仅用一种，尽管在绝大多数情况下用一种氨基酸便已足够了。氨基酸的浓度并不重要，而且在任一具体情况下的最佳浓度取决于诸如待分析样品的稀释度和毛细管性质(包括施加的任何表面处理及其内直径)等因素。一般，最佳结果是用约10-500mM的氨基酸浓度获得的，更佳地为约20200mM。缓冲液优选是水溶液，尽管并不限于任何具体的溶剂。溶液是碱性的以便赋予氨基酸负电荷。尽管碱性度可以改变，但是优选的溶液是pH为约8-11，最佳地约9-10的溶液。用本专利技术的方法分析的样品优选在注射或上样于柱之前用缓冲液稀释过的样品。稀释程度并不关键，可以变化。然而，一般在1份样品对约1-100份缓冲液，更佳地为1份样品对约3-30份缓冲液进行稀释的情况下可获得最佳结果。本专利技术可应用于一般性的蛋白质混合物的液体样品，尤其是用于分析生物流体样品。这种流体的例子有尿液、唾液、脑脊液、全血、血浆和血清。特别是血清样品。缓冲液还可含有添加剂。例如可加入盐类以增加溶液的离子强度，以便提高分离蛋白区带的分辨力。优选的盐类是无机盐如碱金属和碱土金属的卤化物。例子有钠和钾的卤化物如氯化物、碘化物、溴化物和氟化物，其中优选氯化钠。盐浓度并不关键，可以改变，而最佳范围取决于系统的其他参数。典型的范围是约1-10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离液体样品中的蛋白质混合物的方法，其特征在于，该方法包括：通过施加电场通过分离管，而让该样品电泳经过注有氨基酸碱性溶液的毛细管。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：E克鲁斯卡，刘承明，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]