一种白蛋白／角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞系及其建立方法技术

本发明专利技术公开了一种白蛋白／角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞系及其建立方法，本发明专利技术的小鼠胚胎干细胞系由白蛋白／角蛋白双表达的小鼠胚胎干细胞传代培养建立，所述小鼠胚胎干细胞整合有红色荧光／绿色荧光蛋白双报告基因，所述报告基因由组织特异性启动子白蛋白ＡＬＢ或角蛋白ＣＫ１９调控。与基因敲入的方法相比，本发明专利技术利用转染组织特异启动子操纵报告基因的方法更简便、更快捷、具有更大的实用性。利用本发明专利技术的白蛋白／角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞分化，可以明确地分选得到发育阶段均一的肝祖细胞，对接下来的肝祖细胞分化机制研究和细胞移植及治疗带来极大的有益效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及一种白蛋白/角蛋白(ALB/CK19)双表 达小鼠胚胎干细胞系及其建立方法。
技术介绍
胚胎干细胞(ESC)是从哺乳动物囊胚内细胞团中分离得到的全能干细胞，可以无 限增殖并分化为全身200多种细胞类型。胚胎干细胞在悬浮培养情况下可以形成拟胚体 (EB)，拟胚体是胚胎干细胞在体外一定条件下自发形成的类似早期胚胎的球体，其三胚层 的形成与分化基本模拟了体内胚胎早期发育中组织细胞的分化过程。1996年，日本学者 abe等首先检测到了在拟胚体发育过程中内胚层基因的表达，并且其表达模式与小鼠胚胎 发育相一致，说明小鼠胚胎干细胞在体外分化为肝细胞具有可行性。自此，大量有关体外分 化ESC为肝细胞的研究迅速开展起来。由于胚胎干细胞肝向分化得到的细胞复杂多样，如 果要利用分化得到的肝细胞来进行细胞移植和治疗等用途，则需要对分化细胞中的肝细胞 进行标记以利于纯化。所以研究人员对胚胎干细胞进行必要的遗传修饰，利用报告基因，例 如荧光蛋白和细胞膜蛋白等，来标记特定的肝脏发育基因，以利于分化过程中对肝细胞的 形成进行追踪、分选以及定量。 2002年，基因标记技术第一次被应用在ES细胞向肝细胞的分化研究中，Yin实验 室利用基因敲入(Knock in)技术在小鼠ES细胞的甲胎蛋白(AFP)基因后连接绿色荧光蛋 白(EGFP)，用以标记在ES细胞分化过程中产生的肝祖细胞。随后在2003年，Yamamoto等 利用白蛋白ALB启动子调控的EGFP稳定转染胚胎干细胞，建立基因修饰胚胎干细胞系，通 过绿色荧光检测分化得到的肝细胞，并同时证明了标记ALB阳性的细胞具有肝细胞基因表 达特征和功能。随后的几年中，这种利用肝基因调控的报告基因标记分化得到肝细胞的方 法，在体外分化ES细胞的研究中屡见不鲜。日本科学家Teratani和Heo利用EGFP标记 ALB的小鼠胚胎干细胞，分别采用完全不同的诱导方法，成功诱导得到高比例的肝脏细胞， Teratani采用单层培养法，第一步，利用RA剌激细胞为诱导内胚层阶段；第二步，加入生长 因子进行诱导则为肝诱导阶段；第三步，加入OSM继续诱导，为肝细胞成熟阶段；第四步，利 用肝细胞培养液培养分化细胞，对细胞进一步筛选，通过EGFP分选得到ALB阳性的细胞，移 植入肝纤维化损伤小鼠，发现绿色荧光细胞整合入小鼠肝脏同时缓解肝病症状；而Heo采 用拟胚体诱导法，通过氢化可的松、维生素C、尼克酰胺等化合物诱导得到30% ALB阳性的 细胞，将ALB阳性细胞分选后，移植入四氯化碳损伤小鼠和尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂 缺陷性小鼠，结果发现分化得到的ALB阳性细胞能够整合入小鼠肝脏中，并部分恢复小鼠 肝脏功能。从这些研究可以看出，在体外诱导分化过程中，由肝脏基因启动子调控的报告基 因可以标记和分离类肝脏细胞。然而，从小鼠胚胎发育的顺序上来看，肝细胞是由肝祖细胞 (h印atoblast)分化而来，肝祖细胞则来源于内胚层，已经有科学家利用基因敲入技术标记 了内胚层相关基因来研究内胚层的分化情况，例如Gondern和Nishikawa，可是对肝祖细胞的标记和分选的研究却鲜有报道。 肝祖细胞是一种在胚胎肝发育中处于特异时间点的带有肝细胞和胆管表皮细胞 双潜能的细胞类型，在特定的条件下，既可以分化为肝实质细胞又可以分化为胆管细胞。在 以往有关于ES细胞分化为肝祖细胞的报道中，AFP被作为肝祖细胞的一个标志性基因与 EGFP相连，通过检测AFP的表达来证明肝祖细胞的出现，但是实际上，AFP并不仅仅表达在 肝祖细胞中，它同时在脏壁内胚层也有高表达，而脏壁内胚层最终分化为胚外组织并不参 与肝脏的分化和发育，所以AFP的表达不能准确地标定肝祖细胞的存在。目前为止，仍然没 有公认的识别肝祖细胞的表面标志蛋白，所以这给ES细胞分化得来的肝祖细胞追踪和分 选带来一定的困难。但有一点科学家们是肯定的，那就是白蛋白ALB和角蛋白CK19双表达 的细胞则为肝祖细胞。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于，提供一种白蛋白/角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞系。 本专利技术的第二个目的在于，提供一种建立白蛋白/角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞 系的方法。 本专利技术的第三个目的在于，提供一种白蛋白/角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞系的 应用。 本专利技术提供的白蛋白/角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞系，所述小鼠胚胎干细胞系 由白蛋白/角蛋白双表达的小鼠胚胎干细胞传代培养建立，所述小鼠胚胎干细胞整合有红 色荧光/绿色荧光蛋白双报告基因，所述报告基因由组织特异性启动子白蛋白ALB或角蛋 白CK19调控。 根据本专利技术所述的小鼠胚胎干细胞系，所述绿色荧光蛋白为GFP。根据本专利技术所述的小鼠胚胎干细胞系，所述红色荧光蛋白选自mRFP或tdT0MAT0。 根据本专利技术所述的小鼠胚胎干细胞系，所述小鼠胚胎干细胞还整合有筛选基因，具体的，所述筛选基因选自新霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。 本专利技术的建立ALB/CK19双表达小鼠胚胎干细胞系的方法，包括以下步骤 A)构建由启动子调控，包含报告基因、筛选基因的两载体；所述启动子选自白蛋白ALB或角蛋白CK19 ;所述报告基因选自红色荧光蛋白mRFP、 tdT0MAT0或绿色荧光蛋白EGFP ;所述筛选基因选自新霉素抗性基因Neo或潮霉素抗性基因Hygro ; B)将步骤A)所得两载体共转染小鼠胚胎干细胞；C)筛选存活的、带有GFP/mRFP或GFP/tdT0MAT0双基因标记的小鼠胚胎干细胞； D)将步骤C)所得小鼠胚胎干细胞传代培养，建立ALB/CK19双表达的小鼠胚胎干 细胞系。 根据本专利技术所述的方法，所述两载体为以ALB启动子调控的包含mRFP、Hygro基 因的载体以及以CK19启动子调控的包含EGFP、Neo基因的载体。 根据本专利技术所述的方法，所述两载体为以ALB启动子调控的包含EGFP、Neo基因 的载体以及CK19启动子调控的包含人膜白hCD25基因、tdT0MAT0、 Hygro基因的载体。 本专利技术的白蛋白/角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞系的应用，用于标志小鼠胚胎干 细胞分化得到肝祖细胞。 本专利技术选用ALB启动子和CK19启动子分别调控不同的报告基因，建 立了两株基因修饰胚胎干细胞系E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP和E14-ALB-EGFP/ CK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0，这两株胚胎干细胞在体外诱导分化时，可以分化为带有绿色/ 红色荧光标志的CK19/ALB双阳性的肝祖细胞，从而标记肝祖细胞的出现。与基因敲入的方 法相比，本专利技术利用转染组织特异启动子操纵报告基因的方法更简便、更快捷、具有更大的 实用性。利用本专利技术的白蛋白/角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞分化，可以明确地分选得到 发育阶段均一的肝祖细胞，对接下来的肝祖细胞分化机制研究和细胞移植及治疗带来极大 的有益效果。附图说明 图1A是pcDNA3. 1-mAlb-mRFP/hygro (-)载体的结构图；图IB是pmCK19-EGFP载 体的结构图；图1C是pcDNA3. l-mCK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro (-)载体的结构图；图 1D是pmALB-EGFP-N2载体的结构图。 图2是m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白蛋白／角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞系，其特征在于，所述小鼠胚胎干细胞系由白蛋白／角蛋白双表达的小鼠胚胎干细胞传代培养建立，所述小鼠胚胎干细胞整合有红色荧光／绿色荧光蛋白双报告基因，所述报告基因由组织特异性启动子白蛋白ＡＬＢ或角蛋白ＣＫ１９调控。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王欣，李阳芳，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]