一种化学品胚胎毒性预测模型及其建立方法技术

一种化学品胚胎毒性预测模型包括细胞种类；该细胞种类包括核型为XX的SP3ES细胞诱导分化出的心肌细胞。其建立方法包括步骤一、小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养；二、小鼠ES的体外扩增培养；三、小鼠ES的核型分析及性别鉴定；四、小鼠ES多能性的维持和鉴定；五、小鼠ES体外诱导分化为心肌细胞；六、小鼠ES诱导分化的心肌细胞的心肌特异性标志蛋白的免疫化学检测；七、小鼠ES诱导分化的心肌细胞的表达谱的Real-time PCR检测；八、模式化合物的选择；九、模式化合物细胞毒性的检测；十、模式化合物对ES分化能力的抑制效应的检测；十一、模式化合物胚胎毒性的评价。填补EST体系中无雌性小鼠胚胎干细胞的空白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及，尤其设及一种小鼠胚胎 干细胞定向诱导分化为具有搏动能力的屯、肌细胞，并在所获得的屯、肌细胞上建立化学品胚 胎毒性的识别和预测模型，并应用于新化学品胚胎毒性的预测中。
技术介绍
目前，化学品的毒性数据多在实验动物中获得，如急性毒性试验，亚急性毒性试 验，慢性毒性试验等。但是，开展动物实验存在几个不容忽视的问题；1.需要大量的财力， 2.实验周期长，3.需要大量的实验动物，4.因体内影响因素较多，难W进行代谢和机制 研究。出于动物保护原则，Russell和Burch提倡"3R"原则，即减少（Reduction),优化 化efinement)和替代化巧lacement)，无论是从科学角度还是从经济角度，毒理学替代法 对外源性化学物的危害评价及管理都有非常重要的意义。 据欧洲化学品管理、评估和限制机构（REACH)估计，接下来的15年中将会有30000 种化学品需要进行安全性测试，根据现有的测试指南，将牺牲7百万只动物，其中约64%是 用于化学品的生殖和发育毒性评价；每检测2000种新化合物的发育毒性，约需耗资6亿欧 元。而新化合物的数目W每年1000种递增，其中90%W上没有安全性评价的数据。在该 一过程中，无论是动物的使用情况，还是测试过程中人力、物力、财力的消耗，如此巨大的数 字，让人触目惊屯、。 我国幅员迂阔，人口众多，因此在面临评价化合物暴露导致的健康问题时情况将 比其他国家更为复杂。并且由于各地化合物种类、比例不同，在开展流行病学调查的时候重 点也不相同，加上工业快速发展、城市化进程加快的同时也带来了新型污染物及其快速扩 散的问题。毒理学替代法的应用与推广同样适用于我国的国情。自1986年欧盟实施动物福利指导原则W来，欧盟大力支持替代法的发展与使用。 胚胎干细胞试验巧ST)是经过欧洲替代方法研究中屯、巧U化-ECVAM)验证的一类用于预测 化合物潜在胚胎毒性的实验方法。该方法充分利用了胚胎干细胞的分化潜能，设置分化的 观察终点，结合细胞的一般毒理学数据，通过判别方程式对化合物的潜在胚胎毒性进行评 估和分级，从而实现对化合物的安全性评价，属于一种测试方法的替代体系。借助EST，在 诱导的不同阶段或不同的诱导方向进行化学品的暴露，可模拟反应分化过程中化合物对机 体发育的影响，在毒性筛选、毒性祀器官确定、毒性作用机制等毒理学研究中具有独特的优 势。随着国际上干细胞生物学研究的不断深化，胚胎干细胞模型也得到进一步发展，即利 用其分化潜能寻找祀器官或监测分化过程中关键基因的表达，发现化合物对肝脏、肌肉、血 管、骨等器官组织的影响，通过选择多个观察终点，可W分别评估化合物对相应器官组织的 潜在毒性。整个评估周期在10至21天之间，并且在整个实验过程中都不需要用到活体的 动物，节约人力、物力、财力和时间，可重复性强，易于操作，符合国际上化合物毒性评价替 代研究的要求，因而引起广泛的关注。EST适用于从细胞水平分析发育过程，并判断某因素是否具备胚胎毒物或致崎潜 能。目前，EST多选择屯、肌细胞作为分化发育后的衡量指标，其原因有第一、屯、脏发育始于 胚胎发育早期，使得在体外通过诱导胚胎干细胞（简称ES或者ESC)分化为屯、肌细胞模拟 体内的屯、脏发育过程较易实现；第二、屯、脏发育是一个高度特化的过程，对发育过程的细微 干扰即可导致屯、脏发育出现异常，因而具备较高的灵敏度；第S、由于ES诱导分化的屯、肌 细胞具有搏动能力，作为观测终点具有良好的可视性。 为了验证EST的准确性，Scholz进行了W下实验；1.受试物对分化的3T3成纤维 细胞的细胞毒性效应；2.受试物对未分化的ES细胞的细胞毒性效应；3.受试物对ES细胞 向屯、肌细胞分化的影响。W相应的体内试验资料作为根据，在10种受试物中，100%准确地 判断了非胚胎毒性物质，88. 9%准确地判断了弱胚胎毒性物质，91. 7%准确地判断了强胚 胎毒性物质。在此实验数据基础上，结合受试物的体内试验信息，Genschow等建立了判别 方程模型，对化合物的胚胎毒性开展=级预测，即判断化合物为无胚胎毒性、低胚胎毒性或 者高胚胎毒性。EST具备筛选化合物胚胎毒性的功能，因此被世界各大化学品制造商、药厂 等用于对新原料或新药的筛选及胚胎毒性的安全性测试。 国际上许多致力于优化EST的科学家通过大量的研究，提出了EST的标准化操作 流程中存在W下两点亟待优化的地方；第一、EST是基于ES细胞系D3建立和推广的，建议 同时采用其他ES细胞系建立模型，保证评价结果的准确性；第二、观测屯、肌细胞的搏动受 主观因素影响较大，因此建议W分子生物学指标作为观测终点，W提高准确度。 目前，除了D3细胞系外，在其他的研究中，J1，R1，E14TG2a，E14. 1，DBA/llacZ等 ES细胞系也被使用，并发现了不同细胞系对诱导分化的敏感性不同，并造成了分化为具搏 动能力屯、肌的时间存在差异。然而，该些已使用的ES细胞系核型均为XY，即都是"雄性"的 ES。当前尚无利用核型为XX的ES细胞系建立胚胎毒性评价模型并开展应用的先例。 利用分子生物学手段检测关键的特异性基因在ES诱导的屯、肌细胞中的表达可更 精确地建立剂量一效应曲线，在Seiler等人的实验中，强调了利用分子观测终点获得受试 化合物抑制屯、脏发育的相关数据，获得了良好的剂量一效应曲线W及与传统观测终点在评 价结果中的一致性。然而，当前已有的EST仅采用编码屯、肌蛋白重链的基因Myh6作为分子 观测终点，其他的基因的表达情况是否也能作为可用于EST预测化学品胚胎毒性的分子观 测终点，仍待确证。
技术实现思路
为了弥补上诉现有技术中存在的不足，本专利技术公开了一种化学品胚胎毒性预测模 型，包括细胞种类；该细胞种类包括核型为XX的SP3ES细胞诱导分化出的屯、肌细胞。[001引进一步地，还包括分子观测终点；该分子观测终点包括Myl4。 进一步地，该细胞种类还包括核型为XY的R1ES细胞诱导分化出的屯、肌细胞。 进一步地，该分子观测终点还包括cTnT和/或Myh6。进一步地，还包括Myl4的上游引物序列；AAGAAACCCGAGCCTAAGAAGG，和Myl4的下 游引物序列；TGGGTCAAAGGCAGAGTCCT。 进一步地，还包括cTnT的上游引物序列；CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG，cTnT的下游引 物序列；CTCCATCGGGGATCTTGGGT，Myh6 的上游引物序列；GCCCAGTACCTCCGAAAGTC和Myh6 的 下游引物序列；GCCTTAACATACTCCTCCTTGTC。 本专利技术还揭示了如上所述的化学品胚胎毒性预测模型的建立方法，其特征在于， 包括W下步骤：[001引步骤一：小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养；[001引步骤二：小鼠ES的体外扩增培养； 步骤立；小鼠ES的核型分析及性别鉴定； 步骤四：小鼠ES多能性的维持和鉴定； 步骤五：小鼠ES体外诱导分化为屯、肌细胞； 步骤六：小鼠ES诱导分化的屯、肌细胞的屯、肌特异性标志蛋白的免疫化学检测； 步骤^;：;小鼠ES诱导分化的屯、肌细胞的表达谱的Real-timePCR检测； 步骤八；模式化合物的选择；选择4种及W本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化学品胚胎毒性预测模型，其特征在于：包括细胞种类；所述细胞种类包括核型为XX的SP3ES细胞诱导分化出的心肌细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳，程薇，胡庆亮，张星，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：上海;31