一种提高体细胞重编程效率的培养基及方法技术

本发明专利技术提供一种用于诱导体细胞重编程的培养基，所述培养基包括常规的诱导体细胞重编程的培养基和磷脂酸。本发明专利技术还提供一种诱导体细胞重编程的方法，所述方法包括在诱导细胞重编程的任一时期使用本发明专利技术的培养基或者在诱导细胞重编程的任一时期，在培养基中添加磷脂酸。本研究发现磷脂酸-最简单的脂类，添加到用于诱导体细胞重编程的培养基中，可以显著提高体细胞的重编程效率，并添加降低了重编程过程中的细胞凋亡，从而可以获得大量的高质量的iPS细胞，并为iPS细胞在药物筛选及其在未来转化医学上的应用奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种提高体细胞重编程效率的培养基及方法。
技术介绍
胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)作为一种全能干细胞，具有发育的全能性，可以分化成所有器官、组织甚至生殖细胞，这为基因和细胞治疗及再生医学研究带来了新的契机。但是，胚胎干细胞主要是由囊胚期的内细胞团分离培养而产生的，这需要破坏处于发育早期的胚胎，因此人胚胎干细胞的研究因来源问题引发了伦理道德上的争议。另外，异体移植通常引起的免疫排斥反应也限制了ESCs的临床应用。而诱导性多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)的出现有望突破胚胎干细胞应用的瓶颈问题，为医学治疗和生物学研究提供了广泛的材料和方法。利用外源基因可以诱导体细胞的重编程，常用的因子有Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc(OSKM)。但是iPSCs诱导过程中仍存在很多亟待解决的问题，如重编程的四个因子中的c-Myc本身就是一个原癌基因，以至于iPSCs具有一定的致瘤性；iPSCs的诱导效率低，不足1％；且获得的iPS细胞系存在异质性，质量不均一，且多数质量较差(仅有约10％的克隆可以产生嵌合体小鼠)。经研究，可能有几个因素影响着iPSCs产生的质量，如所用外源基因的剂量，培养条件的差异，以及用于初始细胞的添加剂等等。2012年，Esteban等人报道了一种天然的化合物，抗坏血酸(vitaminC,Vc)，能够作为培养基的一种添加剂，抑制p53和p21的表达，同时减缓细胞衰老，提高重编程效率。最近的研究发现，维持人胚胎干细胞(hESCs)多能性却导致小鼠胚胎干细胞(mESCs)的分化的因子FGF2，能够通过下调阻碍体细胞重编程的细胞外基质的表达，从而提高重编程的效率。磷脂酸(phosphatidicacid，PA)是一种常见的磷脂，作为细胞膜的组成成分，是甘油磷脂的生物合成前体，在最近几年已经受到越来越多的关注。磷脂酸可由磷脂酶D(PLD)水解产生，也可经二酰基甘油激酶发生磷酸化而产生。在哺乳动物中，PA能够通过调节酶活性或细胞膜结构改变等多种途径参与细胞的各种生命活动，如膜泡运输，分泌作用，内吞和胞吐作用，细胞骨架的动态构建和细胞分化等。最近的研究结果显示，PA可以通过TRIAP1/PREL1复合体调控线粒体膜上心磷脂(Cardiolipin,CL)的合成和积累，阻止细胞色素C(Cytochrome，Ctyc)的释放，抑制细胞凋亡。体细胞去分化技术近年来连续取得了一系列重大突破，为再生医学的应用提供了新的途径，使得组织器官的再生成为可能。此外，利用疾病来源的iPS细胞建立疾病的细胞模型和动物模型也为探讨疾病发病机制和药物平台筛选开辟了新的领域。同时，深入系统的研究去分化机制，不但对于解决基础科学问题至关重要，而且对于改造和完善细胞命运决定的理论基础也举足轻重，进而将其应用于再生医学的应用也有将会有极大的启示借鉴作用。而极低的诱导效率和所得细胞的不均一严重限制了该技术的应用，如高通量测序和药物筛选等。这些问题都需要专利技术人通过深入研究细胞去分化的调控机制来解答。然而，目前已报道的研究，大多集中在转录因子、小分子抑制剂等在重编程过程中的作用，而对脂类在重编程中的作用研究还未见报道。
技术实现思路
基于以上目的，本申请研究发现，细胞膜的正常组成成分磷脂酸(PA)，添加到重编程培养基中，可以显著提高体细胞的重编程效率并且降低细胞在重编程中的凋亡，从而可以获得大量的高质量的iPS细胞，并为iPS细胞在药物筛选及其在未来转化医学上的应用奠定了基础。本专利技术的一个目的在于，提供一种用于诱导体细胞重编程的培养基，所述培养基含有磷脂酸，并提供了所述培养基在诱导体细胞重编程中的用途。本专利技术的另一个目的在于，提供一种提高体细胞重编程效率的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的。在本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种用于诱导体细胞重编程的培养基，其特征在于，所述培养基包括常规的诱导体细胞重编程的培养基和磷脂酸。优选地，所述培养基中磷脂酸的浓度为100-800μM，更优选地，浓度为200-600μM，进一步优选地，浓度为400μM。优选地，所述常规的诱导体细胞重编程的培养基为N2B27培养基、KOSR培养基、或FBS培养基。其中，所述N2B27培养基主要由以下成分组成：按1:1的体积比混合的DMEM/F12基础培养基和Neurobasal基础培养基，以及体积百分比为所述培养基的1～2％的N2添加剂、体积百分比为所述培养基的1～2％的B27添加剂、25ng/mL的牛血清白蛋白(BSA)以及1000单位/毫升的白血病抑制因子(LIF)。其中，所述KOSR(血清替代物)培养基主要由以下成分组成：KnockoutDMEM干细胞培养基，体积百分比为所述培养基的20％的KOSR、NEAA、Glutmax、1mM的丙酮酸钠、0.1mMβ-巯基乙醇以及1000单位/毫升的白血病抑制因子(LIF)其中，所述FBS培养基主要由以下成分组成：DMEM/F12基础培养基、体积百分比为所述培养基的20％FBS、NEAA、Glutmax、1mM的丙酮酸钠、0.1mMβ-巯基乙醇以及1000单位/毫升的白血病抑制因子(LIF)。其中，所述NEAA为细胞培养添加物，含7种细胞培养所需非必需氨基酸甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。一般可以商购获得，例如所述NEAA可购自Gibco，货号为11140。所述Glutmax为含有L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺稳定形式的二肽。一般可以商购获得，例如所述Glutmax可购自Gibco，货号为35050。优选地，所述体细胞可来源于不同的种属，包括但不限于人类、大猩猩、猴子等。更优选的，所述体细胞为灵长类动物的皮肤成纤维细胞、粘膜上皮细胞、淋巴细胞、毛囊细胞、脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞，骨髓间充质干细胞，其可以从灵长类物种分离得到或者从相关的细胞库购买。更优选的，所述体细胞为人的皮肤成纤维细胞、粘膜上皮细胞、淋巴细胞、毛囊细胞、脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞，骨髓间充质干细胞。优选地，所述培养基还添加了强力霉素(Doxcycline，Dox)、肝糖原合成激酶3β(GSK3β)受体的选择性抑制剂CHIR99021、非ATP竞争性MEK抑制剂PD0325901；优选地，所述强力霉素Dox的浓度为1-5ng/ml，更优选为2ng/ml；优选地，所述CHIR99021的浓度为1-5μM，更优选为3μM；优选地，所述PD0325901的浓度为1-5μM，更优选为1μM。在本专利技术的另一个方面，本专利技术提供一种诱导体细胞重编程的方法，所述方法包括在诱导细胞重编程的任一时期使用本专利技术的培养基培养体细胞或者在诱导细胞重编程的任一时期，在培养基中添加磷脂酸，继续培养体细胞。优选地，在细胞重编程的早期和/或中期使用本专利技术的培养基培养体细胞或者在培养基中添加磷脂酸，继续培养体细胞。具体地，所述方法包括以下步骤：1)将多能性相关基因导入体细胞；2)将已导入多能性相关基因的体细胞制备为单细胞悬液，使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于诱导体细胞重编程的培养基，其特征在于，所述培养基包括常规的诱导体细胞重编程的培养基和磷脂酸；优选地，所述培养基中磷脂酸的浓度为100‑800μM，更优选地，浓度为200‑600μM，进一步优选地，浓度为400μM。

【技术特征摘要】
1.一种用于诱导体细胞重编程的培养基，其特征在于，所述培养基包括常规的诱导体细胞重编程的培养基和磷脂酸；优选地，所述培养基中磷脂酸的浓度为100-800μM，更优选地，浓度为200-600μM，进一步优选地，浓度为400μM。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述常规的诱导体细胞重编程的培养基为N2B27培养基、KOSR培养基或FBS培养基。3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述培养基还添加了强力霉素Dox、肝糖原合成激酶3β受体的选择性抑制剂CHIR99021、非ATP竞争性MEK抑制剂PD0325901；优选地，所述强力霉素Dox的浓度为1-5ng/ml，更优选为2ng/ml；优选地，所述CHIR99021的浓度为1-5μM，更优选为3μM；优选地，所述PD0325901的浓度为1-5μM，更优选为1μM。4.一种诱导体细胞重编程的方法，所述方法包括在诱导体细胞重编程的任一时期使用如权利要求1-3中任一项所述的培养基培养体细胞，或者在诱导细胞重编程的任一时期，在培养基中添加磷脂酸，继续培养体细胞；优选地，在细胞重编程的早期和/或中期使用如权利要求1-3中任一项所述的培养基培养体细胞或者在培养基中添加磷脂酸，继续培养体细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)将多能性相关基因导入体细胞；2)将已导入多能性相关基因的体细胞制备为单细胞悬液，使用常规培养基培养步骤1)中导入多能性相关基因的体细胞，隔天更换培养基，并且在使用所述常规培养基培养体细胞的过程中，选择一天或...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋远，杜明霞，胡宝洋，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11