【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，具体涉及水稻flotillin1基因和importinα4基因的用途，以及抑制flotillin1基因和importinα4基因的转录或翻译的分子在制备试剂盒中的用途。本申请还涉及一种获得能够抵抗病原体的植株的方法。
技术介绍
1、植物病毒感染已经成为农业生产中的第二大病害，每年在全球造成巨大的经济损失。水稻病毒是植物病毒的重要类群之一，严重威胁着东亚地区的水稻产量，轻则导致减产16％，重则绝收。近年来爆发较为严重的主要包括水稻条纹病毒(rice stripe virus，rsv)，南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black-streaked dwarf virus，srbsdv)，水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus,rbsdv)，水稻齿矮病毒(riceragged stunt virus，rrsv)以及水稻草矮病毒(rice grassy stunt virus，rgsv)。因此，阻断病毒在植物宿主内的传播，培育广谱抗病毒的优良品种，是应对病毒病的重要途径。
2、水稻条纹病毒(rice stripe virus,rsv)是单链rna病毒，基因组包括四条rna链(rna1、rna2、rna3、rna4)，共编码七个蛋白(rdrp、ns2、nsvc2、ns3、np、sp、nsvc4)。目前有关rsv与水稻宿主的研究多集中在rsv自身编码的蛋白与水稻宿主因子互作，影响病毒自身复制或者影响植物宿主细胞的基因沉默，免疫，自噬通路等(fu et a
3、综上所述，植物病毒侵染严重威胁着全球经济安全和食品安全，但是有关阻断病毒传播的研究比较匮乏。需要提供一种抗病基因，以应对水稻的病毒侵染。
技术实现思路
1、本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，发现了植物中的flotillin1基因和importinα4对植物病原体的抗性的起负调控作用。因此，制备了敲除flotillin1和importinα4的水稻突变体，并意外的发现该突变体显著的抑制了rsv在水稻中的扩散率，还显著的降低了rsv在水稻中的发病率。并且，该突变体对水稻株高，千粒重及萌发率没有影响。因此，敲除flotillin1基因和importinα4基因的突变体植株在植物抗病中具有较好的应用潜能。
2、因此，在第一方面，本申请提供了一种获得能够抵抗病原体的植株的方法，所述方法包括：减少或抑制所述植株中flotillin1基因和importin α4基因的转录或翻译，从而减少或抑制所述植株中flotillin1基因和importin α4基因所分别编码的蛋白质的表达水平。
3、在某些实施方案中，所述植物是禾本科植物。在某些实施方案中，所述植物选自小麦，大麦，玉米，水稻，高粱。
4、在某些实施方案中，所述病原体是病毒。在某些实施方案中，所述病原体是水稻条纹病毒。
5、在某些实施方案中，所述importinα4基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seq idno:3所示。
6、在某些实施方案中，所述flotillin1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seq idno:1所示。
7、在某些实施方案中，减少或抑制所述植物flotillin1基因和importin α4基因的表达是通过下列的任意一项方法：一个或几个核苷酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个核苷酸的置换、缺失或添加)，位点特异性诱变，甲磺酸乙酯诱变，定向诱导基因组局部突变，或基因编辑(例如，由sgrna引导的基因敲除)。
8、在某些实施方案中，通过设计靶向flotillin1基因和importin α4基因的sgrna，以引导cas9对靶向位点进行编辑。
9、在某些实施方案中，当所述植物细胞中存在flotillin1基因和importin α4基因的几个(例如，1个，2个，3个，4个)拷贝时，使flotillin1基因和importin α4基因的每个拷贝均变成有缺陷的。
10、在本专利技术的具体实施方案中，分别设计了针对水稻flotillin1基因和importin α4基因的sgrna序列，构建相应的含有sgrna和cas9蛋白的载体。使用农杆菌作为基因操作工具携带所述载体靶向地将针对水稻flotillin1基因和importin α4基因的sgrna序列高效导入水稻细胞基因组中，降低了水稻flotillin1基因和importin α4基因的表达水平，显著的下调了flotillin1基因和importin α4在mrna水平和蛋白水平的表达。
11、因此，在某些实施方案中，所述方法通过以下步骤(a)至(f)实现：
12、(a)构建含有sgrna1和sgrna2的载体，所述sgrna1能够靶向所述flotillin1基因或其片段，所述sgrna2能够靶向所述importin α4基因或其片段；
13、(b)将所述载体转化农杆菌；
14、(c)将所述农杆菌侵染植物细胞；
15、(d)任选地，选择具有缺陷的flotillin1基因和importin α4基因的植物细胞；
16、(e)将步骤(c)或(d)的植物细胞生成植物；
17、(f)任选地，筛选具有缺陷的flotillin1基因和importin α4基因的植物，以获得能够抵抗病原体的植物。
18、在某些实施方案中，所述sgrna1和sgrna2构建于同一载体或不同的载体中。在某些实施方案中，所述sgrna1和sgrna2构建于pylcrispr/cas9pμbi-h载体中。
19、在某些实施方案中，所述农杆菌是eha105农杆菌。
20、在某些实施方案中，在步骤(f)中，提取所述植物的rna，将所述rna逆转录为cdna，通过引物扩增所述cdna中包含的sgrna1和sgrna2靶向的核苷酸片段，以进行筛选；或者，提取所述植物的基因组dna，通过引物扩增所述dna中包含的sgrna1和sgrna2靶向的核苷酸片段，以进行筛选。
21、在某些实施方案中，所述sgrna1的核苷酸序列为seq id no:5或seq id no:6。
22、在某些实施方案中，所述sgrna2的核苷酸序列为seq id no:7或seq id no:8。
23、在第二方面，本申请提供了一种特异性抑制flotillin1基因和importinα4基因的转录或翻译或特异性抑制flotillin1基因和importinα4基因所分别编码的蛋白质的表达水平的分子在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于获得能够抵抗病原体的植株，或用于提高植株抵抗病原体的能力。
24、在本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种获得能够抵抗病原体的植株的方法，所述方法包括：减少或抑制所述植株中Flotillin1基因和Importinα4基因的转录或翻译，或者减少或抑制所述植株中Flotillin1基因和Importinα4基因所分别编码的蛋白质的表达水平。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有选自下列的一项或多项特征：
3.如权利要求1或2所述的方法，减少或抑制所述植物Flotillin1基因和Importinα4基因的表达是通过下列的任意一项方法：一个或几个核苷酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个核苷酸的置换、缺失或添加)，位点特异性诱变，甲磺酸乙酯诱变，定向诱导基因组局部突变，或基因编辑(例如，由sgRNA引导的基因敲除)。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，当所述植物细胞中存在Flotillin1基因和Importinα4基因的几个(例如，1个，2个，3个，4个)拷贝时，使Flotillin1基因和Importinα4基因的每个拷贝均变成有缺陷的。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，所述方法通过以下步骤(a)至(f)
6.如权利要求5所述的方法，所述方法具有选自下列的一项或多项特征：
7.如权利要求5或6所述的方法，所述方法具有选自下列的一项或多项特征：
8.特异性抑制Flotillin1基因和Importinα4基因的转录或翻译或特异性抑制Flotillin1基因和Importinα4基因所分别编码的蛋白质的表达水平的分子在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于获得能够抵抗病原体的植株，或用于提高植株抵抗病原体的能力；
9.如权利要求8所述的用途，其中，所述试剂盒还包含：载体，农杆菌，用于培养植物细胞或组织的培养基和/或试剂，用于提取植物DNA或RNA的试剂，扩增包含sgRNA1和sgRNA2分别靶向的片段的引物组，或其任何组合；
10.如权利要求8或9所述的用途，其中，所述方法具有选自下列的一项或多项特征：
11.一种试剂盒，其包含以下(1)至(6)的任意一项或多项：
12.如权利要求11所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于获得能够抵抗病原体的植株，或用于提高植株抵抗病原体的能力；
...【技术特征摘要】
1.一种获得能够抵抗病原体的植株的方法，所述方法包括：减少或抑制所述植株中flotillin1基因和importinα4基因的转录或翻译，或者减少或抑制所述植株中flotillin1基因和importinα4基因所分别编码的蛋白质的表达水平。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有选自下列的一项或多项特征：
3.如权利要求1或2所述的方法，减少或抑制所述植物flotillin1基因和importinα4基因的表达是通过下列的任意一项方法：一个或几个核苷酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个核苷酸的置换、缺失或添加)，位点特异性诱变，甲磺酸乙酯诱变，定向诱导基因组局部突变，或基因编辑(例如，由sgrna引导的基因敲除)。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，当所述植物细胞中存在flotillin1基因和importinα4基因的几个(例如，1个，2个，3个，4个)拷贝时，使flotillin1基因和importinα4基因的每个拷贝均变成有缺陷的。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，所述方法通过以下步骤(...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔峰，葛盘泮，卢虹，马永焕，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：
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