存在LIF时的神经干细胞扩增制造技术

本发明专利技术包括用于增强神经干细胞（ＮＳＣｓ）生长的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】存在LIF时的神经干细胞扩增
技术介绍
在给定时间在给定组织中具有最广阔发展潜能的干细胞是自我更 新的多能祖细胞(multipotent progenitors) (Morrison等，1997 Cell 88:287-298)。最近，神经系统中的干细胞研究已经吸引了许多关注， 不仅由于它们对于理解神经发育的重要性，还由于它们在神经退行性 疾病治疗中的治疗潜能。在中枢神经系统"CNS"的发育过程中，多能前体细胞(也称作 神经干细胞)增殖，产生暂时分裂的细胞，它们最终分化成构成成人 大脑的细胞类型。干细胞(来自其它组织)传统上被定义为具有自我 更新的能力(也就是形成更多干细胞)、具有增殖能力、和具有分化成 多种不同表型谱系(lineages)的能力。在神经干细胞的情况下，这包 括神经元、星形细胞和少突胶质细胞。例如，Potten和Loeffler (1990， Development 110:1001-20)将干细胞定性为能够增殖、自我维持、产生 大量分化的功能产物(progeny)并在受伤后使组织更生的未分化细胞。已经从数种哺乳动物物种中分离出神经干细胞(NSCs)，包括小鼠、 大鼠、猪和人类(WO 93/01275、 WO 94/09119、 WO 94/10292、 WO 94/16718; Cattaneo等，1996， Mol. Brain Res. 42:161-66)。人类CNS 神经干细胞，与它们的啮齿动物同系物类似，在保持在含促细胞分裂 剂(通常是表皮生长因子(EGF)或EGF加上碱性成纤维细胞生长因 子(bFGF))且不含血清的培养基中时，在悬浮培养中生长以形成被称 作"神经球"的细胞聚集体。已经观察到，人类神经干细胞具有大约 30天的倍增(doubling)速率(Cattaneo等，1996， Mol Brain Res.在FGF和EGF存在下7-14天的倍增 时间(Vescovi等，1999 Brain Pathol. 9:569-98)。在去除促细胞分裂剂 时，干细胞可以分化成神经元、星形细胞和少突胶质细胞。为了改进人类胎儿大脑干细胞的生长速率，过去十年期间许多不 同的研究人员已经使用了数种不同的方法和生长因子。已经证实，对 于人类胎儿神经干细胞(hNSCs)的扩增和维持，需要碱性成纤维细胞 生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)。这些人类NSC培养基通 常以自由浮动细胞群(神经球)的形式生长，但是在仅存在bFGF和 EGF的情况下，神经球不能无限增殖。白血病抑制因子(LIF)的添加 表明通过将倍增时间降至7天(Carpenter等，1999， Exp. Neurol. 158:265-278)和4.5天(Wright等，2003 ， J. N画chem. 86:179-795) 来提高NSCs的增殖。人类胎儿大脑干细胞被认为是用于受损组织再生的干细胞移植的 有吸引力的候选物(attractivecandidates)。在遗传全异个体之间的细胞 移植总是与宿主的移植排异相连。几乎所有细胞都表达主要组织相容 性复合体，MHC I类分子。此外，在暴露在促炎细胞因子中时，可以 诱使许多细胞类型表达MHC II类分子。同种异体移植物的排异主要是 以CD4和CD8子类的T细胞为中介的(Rosenberg等，1992 Annu. Rev. Immunol. 10:333)。同种异型反应性CD4 T细胞产生了加剧对同种异型 抗原的细胞溶解性CD8响应的细胞因子。在这些子类中，细胞的竞争 性亚种群(competing subpopulations)在抗原刺激之后发展，它们以其 产生的细胞因子为特征。产生IL-2禾n IFN-7的Thl细胞主要参与了同 种异体移植物排异(Mossmann等，1989 Annu. Rev. Immunol. 7:145)。 产生IL-4和IL-10的Th2细胞可以通过IL-10下调Thl响应(Fiorentino 等，1989 J. Exp. Med. 170:2081)。实际上，已经花费了大量努力以将不 合意的Thl响应转向Th2途径。对患者体内移植的不合意的同种异型反应性T细胞响应通常用免疫抑制药物(例如泼尼松、咪唑硫嘌呤和 环孢霉素A)处理。不幸地，这些药物通常需要患者一生服用并且它 们具有多种危险的副作用，包括全身性的免疫抑制。神经干细胞已经显示表达了低或可忽略量的MHC I类和域II类抗原(McLaren等，2001 J. Neuroimmuno. 112:35)，且按照McLaren等培养的细胞通常在植入同种异体受体后受到排异，除非使用免疫抑制药 物。在受到IFN类的促炎细胞因子作用后，在细胞膜上上调 (up-regulate) 了MHC分子，此后会引发排异。仍然需要提高神经干细胞培养物的增殖速率。还需要提高分化的 细胞群中神经元的数量。进一步需要改进神经干细胞移植物在植入宿 主时的存活力。因此，强烈需要用于使NSCs的增殖和多向分化潜能最 大化的培养条件标准化方法。本专利技术满足了这一需求。
技术实现思路
本专利技术包括用于在涂布表面上培养神经干细胞(NSC)以便在不 损失分化能力的情况下提高增殖速率的组合物和方法。本专利技术包括包含体外贴壁培养物(其含有NSC)的组合物，其中 NSC细胞在存在LIF的情况下增殖，同时保持NSC的多向分化潜能。一方面，NSC粘附到用聚鸟氨酸和纤连蛋白涂布的表面上。另一方面，NSC来自人类。再一方面，已经在NSC中引入外源性遗传物质。本专利技术还包括NSC的多向分化潜能的体外扩增和维持方法。一方面，本方法包括在存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细 胞群的形式培养NSC。另一方面，本专利技术包括在用聚鸟氨酸和纤连蛋白涂布的表面上培 养NSC。再一方面，本专利技术包括培养人类NSC。 在又一方面，已经在NSC中引入外源性遗传物质。本专利技术包括NSC的多向分化潜能的体外扩增和维持方法，该方法 包括在存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培养NSC， 其中通过该方法调节所述NSC中MHC II类分子的表达。本专利技术还包括NSC的多向分化潜能的体外扩增和维持方法，其中 当与在持续存在LIF的情况下培养的其它方面相同的NSC相比，所述 NSC中MHC II类分子的表达降低。一方面，该方法包括在存在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细 胞群的形式培养NSC—段时间，然后从培养物中去除LIF，并在不存 在LIF的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培养所述NSC —段 时间。另一方面，将NSCs在存在LIF的情况下培养大约7天。 再一方面，将NSCs在不存在LIF的情况下培养大约7天。 在又一方面，将NSCs在存在LIF的情况下培养一段时间，然后在不存在LIF的情况下培养一段时间之后，NSCs表现出大约28-36小时的倍增速率。本专利技术包括通过下述方法制成的NSC——该方法是在存在LIF 的情况下在涂布表面上以贴壁细胞群的形式培养所述NSC —段时间， 然后从培养物中去除LIF，并在不存在LIF的情况下在涂布表面上以贴 壁细胞群的形式培养所述NSC —段时间。一方面，NSC表现出大约28-36小时的倍增速率。 另 一方面，与在持续存在LIF的情本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含含有神经干细胞（ＮＳＣ）的体外贴壁培养物的组合物，其中所述ＮＳＣ在存在ＬＩＦ的情况下增殖，同时保持所述ＮＳＣ的多向分化潜能。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S博恩赛尔，P万谷芮，
申请(专利权)人：赛若代姆公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]