一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法技术

本发明专利技术涉及一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法，按照如下步骤操作：第一步，利用机械法分离出生后7天小鼠触须部毛囊；第二步，体外培养毛囊干细胞：毛囊经DMEM/F-12洗完后，置于0.25%?Trypsin-0.04%EDTA，37℃消化10分钟，轻轻吹打混匀后加入10%血清终止消化，于DMEM/F-12中清洗，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养；第三步，将传代两次的毛囊干细胞体外培养形成拟胚体EB；第四步，制作小鼠成纤维细胞培养及饲养层细胞；第五步，EB培养后与饲养层共培养向原始生殖细胞分化。本发明专利技术方法获得了与体内正常原始生殖细胞形态和特异分子标记表达类似的原始生殖细胞。

【技术实现步骤摘要】

:本专利技术涉及一种小鼠毛囊干细胞向原始生殖细胞分化的技术方法，特别是涉及一种将小鼠毛囊干细胞采用体外培养方式，经过形成拟胚体(EB)进行诱导，然后以小鼠成纤维细胞为饲养层采用共培养方式诱导形成原始生殖细胞的方法。属于生殖医学的生物医学

技术介绍
:从2003年开始，多个实验组报导了他们将哺乳类干细胞，包括人类干细胞，诱导为各发育阶段的生殖细胞。在以雄性配子为目标的报导中，2003年Toyooka等首先以Vasa基因为PGC报告系统(reporter system)及BMP4为诱导因子，将小鼠干细胞诱导为PGCs(原始生殖细胞primordial germ cells);并接着将分离出来的PGCs与睾丸细胞混合后移植到睾丸中产生精子。2004年，Geijsen等利用SSEAl为早期生殖细胞表面标记，加上RA(retinoic acids)诱导小鼠干细胞,成功在体外获得单倍体,並将其注射入小鼠卵子中，受精卵发育至囊胚期。德国研究小组Nayernia等同样利用RA诱导小鼠干细胞，并以StraS及Prml为报告系统，获得的类精细胞在注射入卵子后能获得后代。此外，Nayernia本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法，其特征在于按照如下步骤操作：第一步，分离小鼠触须部毛囊：用手术镊子将出生后7天小鼠毛囊从触须部皮肤上取下，转移至磷酸盐缓冲液pH7.0+10%胎牛血清的操作液中清洗，并去除与毛囊连接在一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪，在新鲜细胞培养液DMEM/F?12中将毛囊清洗；第二步，体外培养毛囊干细胞：毛囊经DMEM/F?12洗完后，置于0.25%?Trypsin?0.04%EDTA，37℃消化10分钟，轻轻吹打混匀后加入10%血清终止消化，于DMEM/F12中清洗，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养，以培养当天为零代，每4天传代一次；第三步，毛囊干...

【技术特征摘要】
1.一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法，其特征在于按照如下步骤操作:第一步，分离小鼠触须部毛囊:用手术镊子将出生后7天小鼠毛囊从触须部皮肤上取下，转移至磷酸盐缓冲液PH7.0+10%胎牛血清的操作液中清洗，并去除与毛囊连接在一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪，在新鲜细胞培养液DMEM/F-12中将毛囊清洗；第二步，体外培养毛囊干细胞:毛囊经DMEM/F-12洗完后，置于0.25% Trypsin-0.0496EDTA，37°C消化10分钟，轻轻吹打混匀后加入10%血清终止消化，于DMEM/F12中清洗，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养，以培养当天为零代，每4天传代一次；第三步，毛囊干细胞体外形成拟胚体EB:当毛囊干细胞培养到第二代又3-4天时，离心收集细胞，弃上清，加入0.25%Trypsin室温消化5分钟,然后轻轻吹打至单细胞,终止消化,Medium 199洗两遍后转入24孔板悬浮培养，置于EB培养基中培养；第四步，小鼠成纤维细胞培养及饲养层细胞的制作:将怀孕13.5天的母鼠杀死取出胎鼠，取出头、四肢、内脏、尾将躯干转移至磷酸盐缓冲液清洗，置于0.25% Trypsin-0.04%EDTA, 37°C消化10分钟，轻轻吹打混匀后，加入10%胎牛血清终止，转入成纤维细胞培养基中培养，以培养当天为零代，细胞达90%汇合度时传代；取1-3代成纤维细胞，倒掉培养基，加入含有10 μ g丝裂霉素C的成纤维细胞培养液，置于培养箱中1.5-2小时，取出用磷酸盐缓冲液清洗，用0.25%Trypsin将贴壁的成纤维细胞消化下来，终止后DMEM高糖清洗，转入24孔板贴壁培养；第五步，EB培养后与饲...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙源超，陈波，陈春雷，沈伟，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：