富集精细胞群的方法技术

本发明专利技术公开了不使用物理分选细胞对一种特征选择性富集活精细胞群的方法。在这样富集的群体中含有的细胞得益于未经历分选方法的优势。还公开了利用选择性富集活精细胞群的方法授精雌性哺乳动物的方法以及形成精子分散体的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及富集精细胞群。具体而言，本专利技术一般涉及不物理分选细胞而对活精细胞群的富集。专利技术背景通过人工授精(Al)使动物受精以及体外受精后的胚胎移植已经是ー项成熟的操作。在家畜产业中，能够对繁殖结果施加影响而使其后代具有ー种或多种期望特征有明显的优势。例如，乳制品产业中如能预先选择后代有利于雌性以保证奶牛的产量，则会带来经济效益。将精子分离为富集的带有X和Y染色体的细胞群，即称作的性别富集精子或性别富集精液，便是实现预选后代的方法之一。Johnson等人(美国专利号5，135，759)描述了使用流式细胞仪/细胞分选仪根据DNA内容物将带有完整X和Y染色体的精子群分离为带有X和Y染色体精子富集的细胞群。如所述，将精子与DNA选择性标记物在30°C到39°C的温度下混合I小时(39°C )到I. 5小时(30°C)。接着使用流式细胞仪測量当精子通过激光束时发出的荧光量。由于带有X染色体的精子比带有Y染色体的精子含有更多的DNA(由物种决定约为3<%到5%)，带有乂染色体的精子比带有Y染色体的精子产生更大的荧光光強。使含有预定荧光強度的单个精子的液滴带上电荷并使其静电偏离至收集容器中。接着将收集的性别富集的精子群用于显微注射或人工授精。显然，这一方法需要物理分选精细胞以获得性别富集的精子群。根据JOhnson的物理分选是费时且高成本的。专利技术概沭本专利技术的多方面之一是关于一种特征富集的精子分散体(有时称为悬浮液)的制备方法。在一个实施方案中，例如，将本专利技术的方法用于制备关于X或Y染色体精子富集的精子分散体。简言之，因此，本专利技术涉及选择性降低精细胞分散体中精细胞的亚群使卵受精的能力。该方法包括在液体中形成标记的精细胞的分散体，所述液体包含诱导精子不运动性的化学剂或具有诱导精子不运动性的温度，其中与精细胞结合的标记的存在、缺少或数量指示分散体中精细胞亚群的遗传、蛋白质组学、结构或功能特征。该方法还包括光学检测分散体以鉴定作为亚群成员的个体精细胞；确定分散体中亚群成员的位置；和向分散体内不同位置递送能量剂量以选择性降低亚群成员使卵受精的能力而不类似地影响在分散体中其它位置的精细胞。本专利技术还涉及使用富集的精细胞群授精雌性哺乳动物的方法。该方法包括在液体中形成标记的精细胞的分散体，所述液体包含诱导精子不运动性的化学剂或具有诱导精子 不运动性的温度，其中与精细胞结合的标记的存在、缺少或数量指示分散体中精细胞亚群的遗传、蛋白质组学、结构或功能的特征。该方法还包括光学检测分散体以鉴定作为亚群成员的个体精细胞；确定分散体中亚群成员的位置；向分散体内不同位置递送一定的能量以选择性降低亚群成员使卵受精的能力而不类似地影响在分散体中其它位置的精细胞；和其后使用该分散体或其衍生物授精雌性哺乳动物。本专利技术还涉及体外受精的方法。该方法包括在液体中形成标记的精细胞的分散体，所述液体包含诱导精子不运动性的化学剂或具有诱导精子不运动性的温度，其中与精细胞结合的标记的存在、缺少或数量指示分散体中精细胞亚群的遗传、蛋白质组学、结构或功能的特征。该方法还包括光学检测分散体以鉴定作为亚群成员的个体精细胞；确定分散体中亚群成员的位置、向分散体内不同位置递送能量剂量以选择性降低亚群成员使卵受精的能力而类似地影响在分散体中其它位置的精细胞；和其后使用所述分散体或其衍生物使卵体外受精。可以在其后将受精卵导入雌性哺乳动物的子宮。本专利技术还涉及形成冷冻的精子分散体的方法。该方法包括在液体中形成标记的精细胞分散体，所述液体包含诱导精子不运动性的化学剂或具有诱导精子不运动性的温度，其中与精细胞结合的标记的存在、缺少或数量指示分散体中精细胞亚群的遗传、蛋白质组学、结构或功能的特征。该方法还包括光学检测分散体以鉴定作为亚群成员的个体精细胞；确定分散体中亚群成员的位置；向分散体内不同位置递送能量剂量以选择性降低亚群成员使卵受精的能力而不类似地影响在分散体中其它位置的精细胞；和其后冷冻保藏该分散体。本专利技术的其它方面和特征部分是显而易见的，部分将于下文说明。专利技术详述有利的是，不使用物理分选细胞可以关于根据本专利技术的一种特征富集活的精细胞群。这ー特征可以是，例如，精细胞带有X还是Y染色体。备选地，该特征可以是另ー遗传特征，例如单核苷酸多态性(“SNP”)的存在，所述多态性编码提高的动物生育力(例如，提高的奶产量)，或编码改善所选细胞的冷藏的脂质。该特征还可以是蛋白质组特征，例如提高精子性能的蛋白质，例如将会通过改善有益的顶体特征而提高在子宮内的性能的蛋白质。该特征还可以是结构特征(例如顶体完整性)，或功能特征(例如前向运动性)。可以关于遗传、蛋白质组、结构或功能特征实现精细胞群的富集，其通过，例如标记群体中具有(或，备选地，缺少)该特征的精细胞，使精细胞基本不动和选择性地向不动的精细胞施加一定能量以降低所施用的细胞的存活力或至少降低所施用的细胞在体外或体内使卵受精的能力(即，授精之后)。因为分散体(有时称为悬浮液)中的精细胞基本不运动并且被选择性标记，所以可以将能量束传递到分散体中的特定位置来向个体精细胞施用；通过重复这一方法步骤，即个别地向分散体中不同位置上不运动的精细胞施用，可以有效富集分散体中具有期望特征的精细胞亚群，例如就具有所期望特征的亚群细胞的百分比而论；就由于用精细胞受精而产生的具有某种遗传或蛋白质组特征的子代的百分数而论或就这两者而论有效富集。在任意事件中，可以不用物理分离具有期望特征的细胞与缺少期望特征的细胞(即，不用分离施用的细胞和未施用的细胞)而富集精细胞群的特定亚群。任选地，可以根据下述方法通过物理分离施用的和未施用的细胞成分开的亚群，另外地纯化所述细胞以获得细胞的进ー步富集。精细胞分散体精细胞密度一般而言，可以用宽范围精细胞密度制备具有可以以某种特征富集的群体的精细胞分散体。然而，通常精细胞密度在至少约I X IO3个精子/ml，并且通常不超过约5X IOltl个精子/ml，且更优选地不超过约5X IO8个精子/ml分散体。例如，在一个实施方案中，分散体中可含有“相对低”密度的精子，即精子密度少于约IX IO7个精子/ml，优选少于约IX IO6个精子/ml，更优选约I X IO3至约5 X IO6个精子/ml，还更优选约I X IO3至约I X IO6个精子/ml，甚至更优选约I X IO4至约I X IO5个精子/m l，和最优选约I X IO5个精子/ml分散体。在备选的实施方案中，分散体中可含有“中间”密度的精子，即密度为约I X IO7至约I X IO8个精子/ml分散体。在再一个实施方案中，分散体中可含有“相对高”密度的精子，即精子密度至少为约I X IO8个精子/ml，优选约I X IO8至约5 X 101°个精子/ml，更优选约I. 5 X IO8至约2 X 101°个精子/ml，甚至更优选约I. 5 X IO8至约2 X IO8个精子/ml，还更优选约I. 5 X IO8个精子/ml分散体。因此，例如，在一个实施方案中，分散体中可含有至少约O. 04X 106、在另ー个实施方案中至少约I X 106、在另ー个实施方案中至少约I. 5X 106、在另ー个实施方案中至少约2X 106、在另ー个实施方案中至少约3 X本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2004.07.22 US 60/590,270;2004.07.23 US 60/590,769;定义的发明范围内可对其进行修饰和改变。权利要求1.选择性降低精细胞分散体中精细胞亚群使卵受精的能力的方法，该方法包括 a)用DNA选择性荧光染料标记精细胞样品以形成经标记的精细胞的分散体，其中与精细胞结合的DNA选择性荧光染料的数量表明带有X染色体的精细胞和带有Y染色体的精子; b)任选地检测分散体以鉴定个体精细胞为亚群成员； c)递送能量剂量至分散体以选择性降低亚群成员使卵受精的能力；和 d)从分散体除去被施用的细胞或未被施用的细胞。2.权利要求I的方法，其中所述DNA选择性荧光染料是Hoechst33342、Hoechst33258或 SYBR-H03.权利要求I的方法，其中能量剂量选自辐射束、激光束、平行的非激光光、聚焦的非激光光和聚焦的超声能。4.权利要求I的方法，其中所述方法还包括纯化未接受能量剂量的精细胞。5.权利要求4的方法，其中纯化未被施用的细胞包括使分散体与高密度介质接触。6.权利要求4的方法，其中纯化未被施用的细胞包括离心分散体并移去被施...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·A·格雷厄姆，
申请(专利权)人：英格朗公司，
类型：发明
国别省市：