家畜精原干细胞培养液制造技术

本发明专利技术公开了家畜精原干细胞培养液SSCM，制备方法为：临用前，将SSCB、细胞因子储存液、青霉素储存液、链霉素储存液、Fungizone储存液按下列比例混合均匀：1ml?SSCB，分别添加三种细胞因子储存液各1μl、青霉素储存液1μl、链霉素储存液1μl、Fungizone储存液1μl，混合均匀即得；本发明专利技术公开的家畜精原干细胞培养液适合家畜精原干细胞的长期培养。同时提交的还有家畜精原干细胞长期培养方法，免疫荧光染色鉴定方法，冷冻保存方法等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及的是一种家畜精原干细胞培养液。
技术介绍
精原干细胞(SSCs)是最重要的成体干细胞之一。精原干细胞不仅有传宗接代的遗传功能，近来研究显示，精原干细胞很容易通过退分化产生多能干细胞。这使得精原干细胞操作技术得到生命科学、农业科学和医学各路专家的垂青I。自从精原干细胞移植技术2，3建立以来，精原干细胞的研究得到了空前的发展。近年来又建立了小鼠和大鼠精原干细胞的体外长期培养方法4，5。若要在体外对精原干细胞进行操作，那么首先就要对精原干细胞进行分离和纯化培养。在小鼠睾丸内的全部生殖细胞中，仅有0.03%是干细胞6，因此对精原干细胞进行分离和纯化是培养精原干细胞关键的一步。国内精原干细胞的研究近几年取得了较大的进展。上海交通大学吴际团队在小鼠精原干细胞的自我更生、增殖培养、冷冻储存及睾丸移植等方面的研究取得了好成果7，8。精原干细胞不仅在生殖生物学研究中具有重要价值，也是转基因动物技术研究的新的方向9。制作转基因动物的方法有多种。当前常用的制作转基因动物的方法有两种:DNA原核显微注射法和核移植法。这两种方法的共同点是，都进行胚胎操作；不同点是，夕卜源基因的重组整合时间点不同。原核显微注射法外源基因的重组整合在胚胎显微操作之后，外源DNA只能随机整合，无选择余地，因而产生嵌合体的比例高，产生生殖系遗传的比例低，转基因的表达水平在不同个体中差异大。最大的弱点是成功率低。因此家畜转基因操作已经不用DNA原核显微注射法。核移植法转基因，也称转基因克隆，外源基因的重组整合发生在胚胎显微操作之前，先筛选基因重组体细胞做为供体再进行核移植，因而保证产生的转基因动物具有生殖系遗传特性。但是，核移植法也有它的弱点，除了效率低之外，还常伴有出生体重超常和生理不正常等。核移植过程不能避免表观遗传改变的影响，也使转基因克隆动物对外源基因的表达存在不确定性。用精原干细胞移植法制作转基因动物，既可以先筛选基因重组的精原干细胞，又不会受表观遗传改变的影响。因为精原干细胞在长期培养过程中具有卓越的稳定性和增殖潜能，它们有一个独特的机制，能防止已损坏的遗传基因和表观遗传性状传播给后代。这些特性使精原干细胞成为具有吸引力的目标生殖系的遗传修饰10。这些研究结 果说明用精原干细胞移植法制作转基因动物具有内在的优点。精原干细胞冷冻储存是雄性动物种质资源保存研究的新的分支。至今为止哺乳动物种质资源都是用卵母细胞冷冻保存。一旦精原干细胞长期培养方法和冷冻储存方法都建立起来了，雄性动物的种质资源就有保存方法了，而且比卵母细胞的保存简便，复苏后又可以增殖扩大培养。如小鼠精原干细胞经过2年多的培养，超过(增殖超过10(85)倍)，将其移植到先天性不孕的受体小鼠的生精小管，仍能使其恢复生育力，并产生有正常生育力的后代11。这些特性将使精原干细胞成为有潜力的种质资源。通过退分化诱导精原干细胞能够产生多能干细胞，用于组织器官康复临床医疗的研究及应用12，13，14。精原干细胞及其衍生的多能干细胞在再生医疗方面将有大的作为。也许在不久的将来，男士们就可以通过自己睾丸的一个小小的切片来治愈自身的疾病15。可见精原干细胞在生殖生物学研究、转基因动物技术研究、退分化诱导产生多能干细胞研究、动物种质资源保存研究及组织器官康复临床医疗研究上具有重要意义。精原干细胞培养技术的建立，对多个学科的研究和应用有促进作用。但是，家畜精原干细胞的长期培养至今仍然是世界难题。精原干细胞研究最著名的专家Brinster带领的研究组2008年曾经发表论文说过大动物精原干细胞长期培养方法的建立还需要5至10年的研究16。虽然鼠类的精原干细胞长期培养方法已经建立，种族差别、基因库差别、市售抗体不能通用等多种因素的存在，家畜精原干细胞的长期培养方法不能照搬鼠类的方法。鉴于家畜精原干细胞长期培养技术意义重大，不仅具有理论价值，在农牧业和医学上还具有经济应用价值和社会价值1，美、欧、日、澳、韩等国均有科研组织致力于家畜精原干细胞长期培养的研究，曾有家畜精原干 细胞的纯化、鉴定方面的报道，但是家畜精原干细胞的长期培养还没有成功。国内西北农林科技大学张涌团队在牛精原干细胞分离纯化方面取得了一定的成果17。但是，至今还没有看到完整的家畜精原干细胞长期纯化培养方法、分子水平特异鉴定及遗传修饰的报道。转基因家畜是现代农业发展的方向之一。转基因家畜的制作方法已列入国家十一五科技攻关的转基因专项，对未来国民经济的发展具有重大影响。目前只有转基因克隆技术可用于转基因家畜的制作。上面已经谈及这项技术存的缺陷。且不说它的成功率偏低，动物克隆过程中表观遗传的改变对后代遗传表型的影响至今还没有解决的办法。然而用精原干细胞移植技术产生供体遗传传播的过程不存在后代表观遗传改变的影响。比较而言，用精原干细胞移植技术制作转基因家畜具有天然的优势。用精原干细胞移植技术制作转基因小鼠已经取得成功18。但是，要建立用精原干细胞移植方法制作转基因家畜的技术，首先要实现家畜精原干细胞的长期培养。家畜精原干细胞液是进行精原干细胞长期培养的关键因素之一。本专利技术提供一种多种成分所组成的适用于家畜精原干细胞培养的培养液。这种精原干细胞培养液不含动物血清，辅以滋养层细胞，能够实现家畜精原干细胞的长期培养。本专利技术的培养液可用来建立家畜精原干细胞系，用于长期培养家畜精原干细胞，能维持精原干细胞的标记分子表达特性和分化为精母细胞的分化能力，移植到受体家畜睾丸，能够进入精子发生过程。本专利技术还涉及所述的精原干细胞培养液在长期保藏家畜精原干细胞中的用途。参考文献:[IKanatsu_Shinohara M,Takehashi M,Shinohara T.Brief history,pitfalls,andprospects of mammalian spermatogonial stem cell research.Cold SpringHarbSymp Quant Biol.2008 ；73:17-23.2Brinster R L， Avarbock M R.Germl ine transmission of donorhaplotypefoIlowing spermatogonial transplantation [J].Proc Natl Acad Sci，1994，91:11303-11307.3Brinster R L，Zimmermann J W.Spermatogenesis following malegerm-ceIltransplantation [J].Proc Natl Acad Sci，1994，91:11298-11302.4Shinohara M K，Ogonuki N，Inoue K，et al.Long-term proliferation incultureand germline transmission of mouse male germline stem cells.Biol Reprod，2003,69:612-616.5HamraF K, Chapman K M，Nguyen D M，Wi 11 iams-Stephens A A，Hammer RE，Garbe本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种家畜精原干细胞培养液SSCM，其特征在于，制备方法为：临用前，将SSCB、细胞因子储存液、青霉素储存液、链霉素储存液、Fungizone储存液按下列比例混合均匀：1ml?SSCB，分别添加三种细胞因子储存液各1μl、青霉素储存液1μl、链霉素储存液1μl、Fungizone储存液1μl，混合均匀即得；其中，按照下表配方配制1升SSCB溶液：所述三种细胞因子储存液配制：GDNF储存液：20ng/μl；bFGF储存液：20ng/μl；Gfral储存液：100ng/μl；所述青霉素储存液配制：青霉素100kU/ml；所述链霉素储存液配制：100mg/ml；所述Fungizone储存液：2.5mg/ml。

【技术特征摘要】
1.一种家畜精原干细胞培养液SSCM，其特征在于，制备方法为:临用前，将SSCB、细胞因子储存液、青霉素储存液、链霉素储存液、Fungizone储存液按下列比例混合均匀:Iml S...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴应积，罗奋华，张岩，萨初拉，苏慧敏，刘陶迪，于泊洋，刘林洪，包佳婧，孔群芳，刘代艳，刘燕，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：