一种人脂肪间充质干细胞库及其构建方法技术

本发明专利技术公开一种人脂肪间充质干细胞库及其构建方法，本发明专利技术人脂肪间充质干细胞库由下述步骤构建得到：（1）无菌采集人体脂肪；（2）油脂的去除；（3）胶原酶消化；（4）红细胞的裂解；（5）扩大培养；（6）冻存。人脂肪间质干细胞是脂肪组织中一类多能性干细胞，能诱导分化形成脂肪、骨、软骨、肌肉等组织类型细胞。脂肪组织来源广泛、取材容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、给患者带来的痛苦较小；而且与骨髓等来源的间充质干细胞相比，脂肪来源间充质干细胞增殖快，分离效率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种干细胞库及其构建方法，具体地说是涉及。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现其存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前，我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。但骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题:随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；制备过程不容易质控；移植给异体可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤,患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。这都限制了骨髓间充质干细胞临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。2006年，我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞，这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞 的生物学特性，与传统骨髓间充质干细胞相比，该类间充质干细胞由于来源于更原始的胎盘和脐带，所以免疫原性尚未发育完全，移植后异体的免疫反应不强。再加上胎盘与脐带作为医疗废弃物，更容易获得，取材容易。但是，胎盘和脐带组织来源有限，已经出生的人无法再获得胎盘与脐带，这就诱发我们去寻找就理想的间充质干细胞来源。最近研究发现，脂肪间质干细胞，是脂肪组织中一类多能性干细胞。由于脂肪组织来源广泛、取材容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、给患者带来的痛苦较小，因此日益受到研究者的重视，而且与骨髓来源相比，脂肪来源间充质干细胞分离效率高40倍，200 mL脂肪，可分离出约IXlO6个间质干细胞。目前，研究人员已成功地在体内、体外条件下，将其诱导分化形成脂肪、骨、软骨、肌肉等组织类型细胞。干细胞库就是将干细胞于深低温状态下长期保存。一个完善的干细胞库可为临床细胞治疗提供良好的、足够量的细胞来源。目前，国内主要的干细胞库按来源可分为脐带干细胞库，胎盘干细胞库，牙髓干细胞库，牙周膜干细胞库等；按提供方法可分为公共库和自体库。脂肪间充质干细胞库尚无，特别的是脂肪间充质干细胞自体库尚无
技术实现思路
为了弥补无人脂肪间充质干细胞库的不足，本专利技术提供一种人脂肪间充质干细胞库及其制备方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案: 一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法，其特征在于:包括下述步骤， (1)无菌采集人体脂肪； (2)油脂的去除:将脂肪剪碎，收集于离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静置分层，收集上层部分用磷酸盐缓冲液洗涤； (3)胶原酶消化:加入等体积的胶原酶消化；加入等体积的含10%血清的DMEM-LG终止消化，充分混均后室温静置IOmin分层；去掉上层，离心，收集下层部分； (4)红细胞的裂解:加入2倍体积的红细胞裂解液重悬3min，离心，弃上清；用PBS液清洗，40 μ m滤膜过滤后，向所得细胞中加含10%血清的DMEM-LG培养液，离心收集细胞，并于100U/mL青霉素/链霉素、10%血清的DMEM-LG中培养，即获得人脂肪间充质干细胞； (5)扩大培养:人脂肪间充质干细胞进行扩大培养； (6)冻存:收集扩大培养后的人脂肪间充质干细胞于冻存液中，置液氮冷冻，按AB0/RH分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人脂肪间充质干细胞库。作为本专利技术人脂肪间充质干细胞库的构建方法的一种优选实施方式，步骤(4)得到的人脂肪间充质干细胞需要进行增殖能力验证，选择增殖能力强的人脂肪间充质干细胞进行扩大培养。作为本专利技术人脂肪间充质干细胞库的构建方法的一种优选实施方式，所述血清为自体血清。作为本专利技术人脂肪间充质干细胞库的构建方法的一种优选实施方式，自体血清由下述方法制得:无菌采集外周静脉血20mL，于4°C冰箱静置4h，在37°C温箱孵育4h，1500r/min离心5min，吸取上层血清，0.22 μ m过滤灭菌，在超净工作台内分装，经细菌培养阴性，_20°C保存备用。作为本专利技术人脂肪间充质干细胞库的构建方法的一种优选实施方式，所述人脂肪间充质干细胞库为自体库。一种采用本专利技术人脂肪间充质干细胞库的构建方法构建出的人脂肪间充质干细胞库。与现有技术相比，本专利技术具有显著的有益效果。人脂肪间质干细胞是脂肪组织中一类多能性干细胞，能诱导分化形成脂肪、骨、软骨、肌肉等组织类型细胞。脂肪组织来源广泛、取材容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、给患者带来的痛苦较小；而且与骨髓等来源的间充质干细胞相比，脂肪来源间充质干细胞增殖快，分离效率高，200 mL脂肪，可分离出约I X 106个间质干细胞，是骨髓的40倍。本专利技术提供一种人脂肪间充质细胞库及其构建方法，弥补了无脂肪间充质干细胞库的不足。附图说明 图1自体血清与胎牛血清培养脂肪间充质干细胞增殖柱状图。具体实施例方式为了更好的理解本专利技术，下面结合具体实施方式做进一步说明。一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤: (I)无菌采集人体脂肪:先对脂肪间充质干细胞保存人进行AB0/RH血型分型、HLA分型、微生物学检测，HIV, HBV, HCV, TP检测，然后无菌采集脂肪；采集位点最好是人体脂肪较丰厚的大腿内侧部位；为了方便操作，采集的脂肪条优选长7-8cm。(2)油脂的去除:取5g脂肪组织，先用无菌的手术剪刀或者小刀剪碎，长度要求不大于3mm，然后收集于15mL离心管，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静至5min，等分为两层后小心收集上层部分(包含有间充质干细胞、脂肪细胞、磷酸盐缓冲液及红细胞)，去掉下层的油脂/脂质 ，收集的上层部分采用磷酸盐缓冲液洗涤3遍。(3)胶原酶的消化:加入等体积的0.075%的胶原酶I消化，37°C水浴30min ;加入等体积的含10%血清的DMEM终止消化，充分混均后室温静置IOmin分层；去掉上层(脂质/碎片)，200C，280g离心5min收集下层部分(基质血管部分、干细胞、红细胞)。(4)红细胞裂解:加入2倍体积的红细胞裂解液重悬3min，离心，弃上清；用PBS液清洗，40 μ m滤膜过滤后，向所得细胞中加含10%血清的DMEM-LG培养液，离心收集细胞，并于100U/mL青霉素/链霉素、10%血清的DMEM-LG中培养，即获得人脂肪间充质干细胞。将获得的人脂肪间充质干细胞按1/3接种量接种于24细胞孔培养板中，等待细胞贴壁后加入CCK-8试剂，对获得的人脂肪间充质干细胞进行增殖能力验证。CCK-8试剂在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的四氮唑盐的还原产物。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。(5)扩大培养:选择增殖能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：（1）无菌采集人体脂肪；（2）油脂的去除：将脂肪剪碎，收集于离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静置分层，收集上层部分用磷酸盐缓冲液洗涤；（3）胶原酶消化：加入等体积的胶原酶消化；加入等体积的含10%血清的DMEM?LG终止消化，充分混均后室温静置10min分层；去掉上层，离心，收集下层部分；（4）红细胞的裂解：加入2倍体积的红细胞裂解液重悬3?min，离心，弃上清；用PBS液清洗，40μm滤膜过滤后，向所得细胞中加含10%血清的DMEM?LG培养液，离心收集细胞，并于100U/mL青霉素/链霉素、10%?血清的DMEM?LG中培养，即获得人脂肪间充质干细胞；（5）扩大培养：对人脂肪间充质干细胞进行扩大培养；（6）冻存：收集扩大培养后的人脂肪间充质干细胞于冻存液中，置液氮冷冻，按ABO/RH分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人脂肪间充质干细胞库。

【技术特征摘要】
1.一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，包括下述步骤: (1)无菌采集人体脂肪； (2)油脂的去除:将脂肪剪碎，收集于离心管中，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静置分层，收集上层部分用磷酸盐缓冲液洗涤； (3)胶原酶消化:加入等体积的胶原酶消化；加入等体积的含10%血清的DMEM-LG终止消化，充分混均后室温静置IOmin分层；去掉上层，离心，收集下层部分； (4)红细胞的裂解:加入2倍体积的红细胞裂解液重悬3min，离心，弃上清；用PBS液清洗，40 μ m滤膜过滤后，向所得细胞中加含10%血清的DMEM-LG培养液，离心收集细胞，并于100U/mL青霉素/链霉素、10%血清的DMEM-LG中培养，即获得人脂肪间充质干细胞； (5)扩大培养:对人脂肪间充质干细胞进行扩大培养； (6)冻存:收集扩大培养后的人脂肪间充质干细胞于冻存液中，置液氮冷冻，按AB0/RH分型和HLA...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯文峰，列浦昌，佘志勇，方海庆，
申请(专利权)人：广州爱菲科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：