本发明专利技术涉及一种免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法。本发明专利技术还提供一种免疫抑制剂体外诱导制备得到的耐受性树突状细胞及其应用。本发明专利技术优点在于：本发明专利技术的一种免疫抑制剂体外诱导培养耐受性DC的方法，可以从外周血中获得高纯度免疫抑制功能强的耐受性DC，在液氮中长期保存，能够满足临床对耐受性DC细胞制品的需求，用于预防和治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种细胞体外诱导培养和保存方法，具体地说，是一种外周血来源的耐受性树突状细胞体外诱导培养和保存方法。
技术介绍
自身免疫病主要特征是缺乏对自身抗原的耐受从而诱导了损伤性的免疫反应导致组织损伤。自身免疫病主要的治疗方法是应用免疫抑制剂，采用免疫抑制剂会增加感染和肿瘤的风险。而细胞治疗是一种新颖的治疗手段。通过自体或异体的体细胞体外培养诱导,产生具有某种免疫耐受功能的细胞,输注到免疫病患者体内，抑制免疫系统对自身抗原的过度活化。细胞治疗安全性高，可以有针对地发挥作用，已经成为了一门新兴的热门学科。受体对MHC不匹配的移植物发生排斥反应是组织和细胞移植失败的主要原因。在目前临床实践中，传统免疫抑制药物的使用，虽能有效防止移植排斥，缓解由供者T细胞介导的急、慢性移植物抗宿主病，但常伴有受者整体免疫功能下降，感染机会增加和诱发肿瘤等副作用。因此，以诱导供受者之间移植免疫耐受为目的的细胞治疗方法日益受到重视。研究者发现，在体外IL-10、TGF-β条件下培养的树突状细胞与正常的未成熟树突状细胞(DC)相比表达更低的共刺激分子且不能被LPS等促成熟，在体外能诱导同种异体T细胞产生抗原特异性低免疫反应。将经体外调节培养后产生的显示未成熟DC表型且在体内外能诱导T细胞低反应性及耐受的DC统称为耐受性DC，耐受性DC可以分泌负向调节性因子。耐受性DC也被用于小鼠实验研究移植耐受和自身免疫病的治疗，如在小鼠移植物抗宿主病模型中IL-lOJGF-β诱导的耐受性DC可以延缓GVHD的发生；IL_10诱导的耐受性DC IFN-Y分泌减少，下调机体免疫反应，阻止了实验性滋生免疫性重症肌无力的进一步发展。IL-10诱导的耐受性DC对小鼠的自身免疫糖尿病有抑制作用。但是无论是IL-10、TGF-β或两者诱导得到的耐受性DC易受微环境影响，抑制同种异基因反应弱，所以对耐受性DC免疫抑制功能的 优化是当前需解决的主要问题。另一方面，免疫抑制剂除影响机体免疫系统外已显示出可以干扰更早期的免疫反应，如在DC分化成熟过程中干预其功能。研究发现用一些免疫抑制剂如地塞米松、雷帕霉素等能增强和稳固DC的耐受性能，促进DC的耐受活性。综上所述，在体外联合免疫抑制剂与细胞因子诱导DC，建立培养人外周血来源的耐受性DC的一种新方法，将极大地推动DC细胞临床防治自身免疫性疾病、移植物抗宿主病和同种异基因器官移植排斥的开展。目前，关于IL-10和TGF- β诱导耐受性DC的方法较多以及免疫抑制剂如地塞米松、雷帕霉素等作用于DC的研究也有报道，但将免疫抑制剂他克莫司用于体外诱导培养临床可用的耐受性DC的方法还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供。本专利技术的再一的目的是，提供一种免疫抑制剂体外诱导培养得到的耐受性树突状细胞。本专利技术的另一的目的是，提供一种免疫抑制剂体外诱导培养得到的耐受性树突状细胞的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是:，所述的免疫抑制剂为他克莫司。所述的免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，包括以下步骤:a、用密度梯度离心法分离得到的人外周血单个核细胞用含ACD-A抗凝剂的PBS缓冲液洗涤细胞，培养皿中贴壁DC前体细胞，进一步在细胞因子作用下诱导DC细胞；b、在细胞因子诱导DC前体细胞向DC分化的过程中，培养皿中添加免疫抑制剂他克莫司诱导其分化为耐受性DC;C、将所述他克莫司诱导培养的耐受性DC做功能鉴定并保存于液氮中。所述的步骤a中洗涤细胞的缓冲液为含体积百分数为1.6%的ACD-A抗凝剂的PBS。所述的步骤a中得到的外周血单个核细胞用含自体灭活血浆的1640培养液培养，所述的自体灭活血浆为和培养诱导的细胞同源的血浆。所述的步骤a中采用 CellGro无血清培养基培养前体细胞7天，分别在第0、3、5天添加细胞因子IL-4、GM-CSF。所述的步骤b中，在诱导DC前体细胞向DC分化的过程中，于第3、5天添加免疫抑制剂他克莫司，终浓度为ixio_8m。所述的步骤c中他克莫司诱导培养的耐受性DC与冷冻保护剂预处理后，分装入冻存管或冷冻袋中液氮-196 °C保存。所述的培养诱导7天的耐受性DC纯度在85%以上，存活率80_92%，表达DC标志⑶209以及低表达共刺激分子⑶80、⑶83、⑶86和HLA-DR。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是:以上任一所述的方法制备得到的耐受性树突状细胞。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是:所述的耐受性树突状细胞在制备具有免疫耐受功能的树关状细胞制品中的应用，所述的树关状细胞制品是用于预防和治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥的树突状细胞制品。本专利技术优点在于:本专利技术的利用免疫抑制药物他克莫司体外诱导培养耐受性DC的方法，可以从外周血中获得高纯度免疫抑制功能强的耐受性DC，在液氮中长期保存，能够满足临床对耐受性DC细胞制品的需求，用于预防和治疗自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、器官移植排斥。附图说明图1是诱导培养7天流式细胞仪检测耐受性DC的表型及存活率。他克莫司诱导培养的耐受性DC (TAC-DC)表达DC标志CD209，与成熟DC (mDC)相比表达较低的共刺激分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR，并且比细胞因子IL-lO/TGF-β诱导的耐受性DC (DCIL_10/TGF-e )以及其他免疫抑制剂地塞米松、环孢霉素A诱导的耐受性DC (DX-DC, CsA-DC)表达更低的共刺激分子。他克莫司诱导培养的耐受性DC存活率在80-92%。图中，成熟树突状细胞(mDC) ;IL-10/TGF-13诱导的耐受性树突状细胞);地塞米松诱导的耐受性树突状细胞(DX-DC);环孢霉素诱导的耐受性树突状细胞(CsA-DC);他克莫司诱导的耐受性树突状细胞(TAC-DC)。图2是他克莫司诱导的耐受性DC对异源效应T细胞的低反应性。从外周血磁珠分离得到⑶4+⑶25-T细胞作为效应T细胞(Tste),经CFSE染色后与DC共孵育后检测T效应细胞的增殖率，他克莫司诱导培养的耐受性DC几乎不引起异源Tste细胞的扩增。图中，成熟树突状细胞(mDC) ;IL-10/TGF-13诱导的耐受性树突状细胞(DCLTCF_e );地塞米松诱导的耐受性树突状细胞(DX-DC);环孢霉素诱导的耐受性树突状细胞(CsA-DC);他克莫司诱导的耐受性树突状细胞(TAC-DC )。图3是他克莫司诱导培养的无关第三方耐受性DC抑制混合淋巴细胞反应。外周血来源的mDC与异源的CFSE染色的Tste进行混合淋巴细胞反应，分别加入不同方法诱导的耐受性DC，耐受性DC与Tste比例为1:5。培养5天后收集细胞并用流式细胞仪进行结果分析。他克莫司诱导培养的耐受性DC具有更强的抑制混合淋巴细胞反应。图中，IL-lO/TGF-β诱导的耐受性DC (DClxtcf^ );地塞米松联合IL-lO/TGF-β诱导的耐受性DC (DX-DCIL_10/TGF-@ ^ ;环抱每素A联合IL_10/TGF_β诱导的耐受性DC (CsA-DC IL-1O/TGF-0 );他克莫司联合IL-10/TGF- β诱导的耐受性DC (TAC-DCil_1o/tgf_0 );地塞米松联合TGF- β本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，所述的免疫抑制剂为他克莫司。
【技术特征摘要】
1.一种免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，所述的免疫抑制剂为他克莫司。2.根据权利要求1所述的免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤:a、用密度梯度离心法分离得到的人外周血单个核细胞用含ACD-A抗凝剂的PBS缓冲液洗涤细胞，培养皿中贴壁DC前体细胞，进一步在细胞因子作用下诱导DC细胞；b、在细胞因子诱导DC前体细胞向DC分化的过程中，培养皿中添加免疫抑制剂他克莫司诱导其分化为耐受性DC;C、将所述他克莫司诱导培养的耐受性DC做功能鉴定并保存于液氮中。3.根据权利要求2所述的免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，所述的步骤a中洗涤细胞的缓冲液为含体积百分数为1.6%的ACD-A抗凝剂的PBS。4.根据权利要求2所述的免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，所述的步骤a中得到的外周血单个核细胞用含自体灭活血浆的1640培养液培养，所述的自体灭活血浆为和培养诱导的细胞同源的 血浆。5.根据权利要求2所述的免疫抑制剂体外诱导耐受性树突状细胞的方法，其特征在于，所述的步骤a中采...
【专利技术属性】
技术研发人员：任亚娜，范华骅，谢如锋，杨洁，刘李栋，杨懿铭，
申请(专利权)人：上海市血液中心，
类型：发明
国别省市：
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